劉麗華++沈衛(wèi)德++李兵

摘要：細(xì)胞周期蛋白（cyclin）是調(diào)控真核生物細(xì)胞有絲分裂的重要蛋白。以家蠶1～5齡幼蟲的眠蠶和起蠶為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對家蠶cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在不同齡期幼蟲蛻皮過程中的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達(dá)，表明此時(shí)幼蟲器官發(fā)育基本完成，細(xì)胞分裂遲緩。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達(dá)量均隨著幼蟲的發(fā)育進(jìn)程逐漸增加，表明細(xì)胞分裂過程加劇，促進(jìn)家蠶個(gè)體的不斷生長；眠期則沒有規(guī)律性變化。在2～5齡幼蟲中，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達(dá)量均為起蠶期高于眠期，眠期最重要的生理過程是細(xì)胞凋亡，因此眠期細(xì)胞周期蛋白家族基因表達(dá)水平較低，而CyclinB3基因在整個(gè)幼蟲時(shí)期幾乎不表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果為細(xì)胞周期蛋白在家蠶蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：家蠶；細(xì)胞周期蛋白；家族基因；幼蟲；表達(dá)譜

中圖分類號： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0045-02

細(xì)胞周期主要受細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）在G1/S期和G2/M期2個(gè)限制點(diǎn)的調(diào)控[1]。其中，CDK是真核生物細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，依賴Cyclin發(fā)揮其功能。Cyclin 的表達(dá)具有典型的周期性和時(shí)相特異性，可作為調(diào)節(jié)亞基與相應(yīng)的CDK形成復(fù)合物，并正調(diào)節(jié)CDK的活性。不同Cyclin在不同時(shí)相可通過相應(yīng)的CDK促進(jìn)完成細(xì)胞周期[2]。

Cyclin廣泛存在于多種生物體內(nèi)[3-4]，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)20多種細(xì)胞周期蛋白家族成員[5]，在家蠶體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)6種。CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1、CyclinH 均是家蠶細(xì)胞完成細(xì)胞周期必不可少的。有研究表明，CyclinA在S期、G2期到M期的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮作用[6]；CyclinB 和CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是M期的限制因素[7]；CyclinE是G1期向S期轉(zhuǎn)變中最重要的周期蛋白[8]；CyclinL1、H可能對細(xì)胞周期起調(diào)控作用[9-10]。

家蠶屬于完全變態(tài)發(fā)育昆蟲，一生要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹、成蟲4個(gè)形態(tài)和機(jī)能完全不同的發(fā)育階段[11]。幼蟲是攝取營養(yǎng)、快速生長的發(fā)育階段，幼蟲期每個(gè)齡期之間都要經(jīng)歷眠期和蛻皮的過程，不同發(fā)育階段的細(xì)胞均要進(jìn)行重組和分化，此過程必然受到Cyclin的調(diào)控。采用RT-PCR方法，在家蠶 1～5齡眠蠶和起蠶不同發(fā)育時(shí)期，研究直接影響細(xì)胞增殖分化的家蠶Cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在蠶體的轉(zhuǎn)錄特征。本試驗(yàn)結(jié)論為Cyclin在家蠶蛻皮變態(tài)發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1家蠶供試家蠶品種為大造，由蘇州大學(xué)蠶桑實(shí)驗(yàn)室保存，于（25±1） ℃、相對濕度60%～75%條件下，用新鮮桑葉飼育。分別取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶各10頭，雌雄各半，凍存于液氮中備用。

1.1.2主要試劑總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒、其他化學(xué)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1家蠶總RNA提取及cDNA制備按照Trizol試劑盒說明書分別提取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測定其純度和質(zhì)量濃度。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的1～5齡眠蠶、起蠶總RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照Real-Time PCR的要求，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Actin3內(nèi)參基因及CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物（表1）。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒對各基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程由ABI 7300型測定儀軟件自動(dòng)設(shè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別將CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、Actin3基因以10倍梯度稀釋為6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，進(jìn)行Real-TimePCR。以所得循環(huán)閾值（CT值）為縱軸，以表1檢測基因與內(nèi)參基因的引物

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用ABI 7300型儀器自帶的Sequence Detection Software Version 1.3.1軟件處理RT-PCR的結(jié)果數(shù)據(jù)，并參照Schefe的方法[12]進(jìn)行效率校正。采用SPSS 16.0軟件制作圖表。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA純度和質(zhì)量濃度的測定

提取各組織總RNA的D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0，表明所提取總RNA的純度較高，無基因組、蛋白質(zhì)、其他雜質(zhì)污染。所提取總RNA的質(zhì)量濃度為1.1～2.8 μg/μL。

2.2Cyclin家族基因在家蠶幼蟲不同時(shí)期的表達(dá)

細(xì)胞周期蛋白家族基因在家蠶幼蟲各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況見圖1。1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達(dá)。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達(dá)量均隨著幼蟲的發(fā)育進(jìn)程逐漸增加，4齡起蠶達(dá)到最大值，5齡時(shí)稍有下降；眠期則沒有規(guī)律性變化。在2～5齡，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達(dá)量均為起蠶期高于眠期，而CyclinB3基因在整個(gè)幼蟲時(shí)期幾乎不表達(dá)。

3結(jié)論與討論

昆蟲蛻皮是復(fù)雜的生理生化過程。已有研究表明，昆蟲蛻皮、變態(tài)發(fā)育過程是在蛻皮激素與保幼激素的協(xié)同調(diào)控下，大量基因按照一定的時(shí)間、空間次序被誘導(dǎo)或抑制表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。從細(xì)胞周期蛋白家族基因表達(dá)的變化探討蛻皮過程，可促進(jìn)昆蟲蛻皮分子機(jī)制的深入研究。

本研究結(jié)果顯示，家蠶幼蟲無論是眠蠶還是起蠶，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在1齡幼蟲幾乎均不表達(dá)?？梢?，家蠶由受精卵發(fā)育至1齡幼蟲時(shí)，幼蟲器官基本發(fā)育完成，因此細(xì)胞分裂遲緩，這與筆者前期試驗(yàn)中Cyclin家族基因在家蠶胚胎期的表達(dá)結(jié)果相同。與起蠶期相比，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在眠期的表達(dá)量均較低。可能的原因?yàn)?，眠期的主要生理活?dòng)是蛻去舊表皮、形成新表皮，此期維持生命活動(dòng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量主要由貯藏在脂肪體中的營養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)生；細(xì)胞凋亡是此期最重要的生理過程，因此Cyclin家族基因表達(dá)水平較低。在起蠶期，Cyclin家族基因（CyclinB3基因除外）表達(dá)水平隨著幼蟲齡期推進(jìn)持續(xù)增加，表明細(xì)胞分裂過程加劇，促進(jìn)家蠶個(gè)體不斷生長；至4齡起蠶達(dá)到小高峰，之后稍有下降，家蠶生殖器官在3齡末至4齡初迅速發(fā)育，從而進(jìn)入成熟期[13]。筆者前期對Cyclin家族基因的定量研究表明，其在生殖細(xì)胞中均顯著表達(dá)[14]，這可能是導(dǎo)致CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達(dá)量增加的原因。

CyclinB、CyclinB3基因是家蠶細(xì)胞周期M期的限制因素。在本試驗(yàn)中，CyclinB3基因在眠期和起蠶期幾乎均不表達(dá)，表明CyclinB基因在幼蟲蛻皮過程中起主導(dǎo)作用，而CyclinB、CyclinB3基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控作用的不同之處有待進(jìn)一步研究。

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