鄭 霄 陳蘇靖 李芳芳 鄧 娟 鄭冬云*,2,3
(1.中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院湖北武漢 430074;2.中南民族大學(xué)腦認(rèn)知國家民委重點實驗室湖北武漢 430074;3.醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室湖北武漢 430074)
撲熱息痛亦稱對乙酰氨基酚,它是一種常見的非抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥[1],但過量服用該藥會出現(xiàn)一些毒副作用[2],因此對藥品中撲熱息痛含量的準(zhǔn)確測定具有十分重要的生物醫(yī)學(xué)意義。目前,常用于撲熱息痛含量測定的主要有分光光度法、高效液相色譜法、紅外光譜法、電化學(xué)發(fā)光法、酶催化光度法、電化學(xué)傳感法等方法。其中,電化學(xué)傳感法具有操作簡單、成本低、線性范圍寬、靈敏度高,響應(yīng)時間短等特點,可實現(xiàn)對撲熱息痛的在線實時動態(tài)檢測[3]。
鉛筆芯是由粘土和石墨按一定比例混合而制成的,它具有良好的導(dǎo)電性。鉛筆芯電極即是以普通鉛筆芯為基體材料制作而成,與其他固體電極相比,具有易于修飾、電位窗口寬、殘余電流小、生物兼容性好等優(yōu)點[4]。此外,與同為碳質(zhì)電極的玻碳電極相比,鉛筆芯電極與玻碳電極有相似的伏安響應(yīng),并且它的制備方法簡單、價格低廉、比表面積大、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好[5,6]。因此,鉛筆芯電極及化學(xué)修飾鉛筆芯電極在電化學(xué)傳感領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[7-9]。
本工作以2B鉛筆芯為基體自制了裸鉛筆芯電極,并將其置于0.1 mol/L KClO4和Na2CO3混合溶液中進(jìn)行簡單的循環(huán)伏安掃描,對電極表面進(jìn)行活化,有效改善了電極的表面性能,提高了電極對撲熱息痛的富集量及傳感靈敏度。同時,對撲熱息痛在活化鉛筆芯電極上的電化學(xué)反應(yīng)機理也進(jìn)行了探討。該撲熱息痛電化學(xué)傳感器具有制備簡單、線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點,并被成功應(yīng)用于實際樣品中撲熱息痛含量的測定。
CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);Sirion 200場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI公司);CL-200集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(金壇市予儀器有限責(zé)任公司);pHS-3E酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司)。鉛筆芯(直徑為0.5 mm,2B,廠家:TOUCH LINE)和環(huán)氧樹脂膠(AB膠)均購自超市;導(dǎo)電銀膠購自深圳市鑫威新材料股份有限公司。
多巴胺(DA)、尿酸(UA)、抗壞血酸(AA)購自Fluka化學(xué)試劑公司;撲熱息痛、無水乙醇、Na2CO3、KClO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗所用的其他試劑均為分析純,實驗用水為超純水。
撲熱息痛緩釋片(泰諾,本品每片含主要成分撲熱息痛0.325 g)。
1.2.1 裸鉛筆芯電極的制備依據(jù)文獻(xiàn)方法[10,11]制備裸鉛筆芯電極。用導(dǎo)電銀膠將銅絲與2 cm長的小段鉛筆芯牢固粘接在一起,然后小心緩慢插入塑料槍頭中。用AB膠將塑料槍頭的兩端進(jìn)行密封,并將外露的鉛筆芯長度裁剪至5 mm,即制得裸鉛筆芯電極(Pencil Graphite Electrode,PGE)。使用之前將裸PGE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]+1 mol/L KCl混合液中,在-0.2~+0.8 V電位范圍內(nèi),以50 mV/s的速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,并確保所制備的裸PGE均具有幾乎相同的電極面積,這是保證所制備的傳感器具有良好重現(xiàn)性的重要前提。
1.2.2 活化鉛筆芯電極的制備將裸PGE置于0.1 mol/L KClO4和Na2CO3混合溶液中,在-0.3~+2.0 V電位范圍內(nèi),采用循環(huán)伏安法,以100 mV/s掃描速率環(huán)掃8圈,所制得的電化學(xué)活化鉛筆芯電極(Electrochemically Activated Pencil Graphite Electrode,EAPGE)即為撲熱息痛電化學(xué)傳感器。
1.2.3 撲熱息痛的電化學(xué)檢測檢測體系均采用三電極系統(tǒng)。其中,裸PGE或EAPGE為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑電極為對電極。檢測底液:0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.0),掃描電位范圍:0~0.8 V,富集電位:0.2 V,富集時間:40 s。
為探究EAPGE對撲熱息痛的電催化機理,對不同電極的表面形貌進(jìn)行了掃描電子顯微鏡(SEM)表征,如圖1所示。裸PGE的表面呈典型的石墨片層結(jié)構(gòu),表面比較光滑平整(圖1A);而在EAPGE表面,僅有小部分石墨片層結(jié)構(gòu)依稀可見,而大部分都被侵蝕,呈碎片狀,整個表面凹凸不平,較疏松多孔(圖1B)。顯然,相較于裸PGE,EAPGE具有較大的表面積,這有利于撲熱息痛在電極表面的富集,從而有效提高撲熱息痛電化學(xué)傳感的靈敏度。
圖1 裸PGE(A)和EAPGE(B)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of bare PGE(A) and EAPGE(B)
裸PGE的循環(huán)伏安掃描電化學(xué)活化過程如圖2所示。在活化過程中,于1.55 V左右出現(xiàn)了一個氧化峰,對應(yīng)于C的氧化。同時,第1圈的氧化峰峰形較好,峰電流較大,且伏安曲線平滑,說明電極表面比較光滑平整。在2~8圈的掃描過程中,伏安曲線鋸齒狀,噪音較大,峰電流較小,在實驗過程中可觀察到電極表面有氣泡產(chǎn)生。說明電極表面正在被腐蝕而變得疏松,這與SEM表征結(jié)果一致。Allen等[12]的研究表明,在碳電極的電化學(xué)活化過程中,碳電極中的C可與底液中的O2反應(yīng)生成CO2,而CO2溶于底液后又可以生成可溶性碳酸鹽,而不管是CO2的產(chǎn)生還是可溶性碳酸鹽的生成,均會對碳電極造成侵蝕,使其表面變得疏松,與待測底物的有效接觸面積增大。
采用K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]對EAPGE的電化學(xué)性能進(jìn)行了表征(圖3)。相比于裸PGE,在EAPGE上 [Fe(CN)6]3-/4-的氧化與還原峰電流均增大,其氧化峰電位略微升高而還原峰電位略微降低。前者可能歸因于EAPGE較大的比表面積,后者可能是由于EAPGE表面含有一些含氧基團[13,14],如羥基、羧基、羰基等。這些基團均帶有負(fù)電荷,會對[Fe(CN)6]3-/4-產(chǎn)生靜電排斥作用。
圖2 裸PGE在含有0.1 mol/L KClO4和Na2CO3溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of bare PGE in 0.1 mol/L KClO4 and Na2CO3 solution Scan rate is 100 mV/s.
圖3 裸PGE和EAPGE在含有1 mol/L KCl的5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of bare PGE and EAPGE in 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4- and 1 mol/L KCl solution Scan rate is 50 mV/s.
圖4 裸PGE(內(nèi)插圖)和EAPGE在含有2.0×10-5 mol/L(實線)和0 mol/L撲熱息痛(虛線)的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of bare PGE(insert) and EAPGE in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0) containing 2.0×10-5 mol/L(black solid line) and 0 mol/L paracetamol(gray dash line) Scan rate is 100 mV/s.
采用循環(huán)伏安法對2.0×10-5mol/L撲熱息痛在裸PGE和EAPGE上的電化學(xué)響應(yīng)進(jìn)行了考察。撲熱息痛的電化學(xué)反應(yīng)是一個準(zhǔn)可逆過程,且氧化峰峰形明顯優(yōu)于還原峰,因此選擇氧化峰作為研究對象。其中,在裸PGE上可以看到一個比較小而鈍的氧化峰,其峰電位Ep=0.422 V,峰電流Ip=2.201×10-6A(圖4內(nèi)插圖)。在EAPGE上,當(dāng)?shù)滓褐胁缓瑩錈嵯⑼磿r觀察不到電化學(xué)響應(yīng)(圖4中虛線),而當(dāng)?shù)滓褐泻?.0×10-5mol/L的撲熱息痛時,可以看到一個比較大而尖銳的氧化峰,峰電位Ep=0.409 V,峰電流Ip=2.452×10-5A(圖4中實線)。相比于裸PGE,撲熱息痛在EAPGE上的電化學(xué)響應(yīng)得到了明顯改善,峰電位降低了13 mV,峰電流增大了22.32 μA,約為10倍。這說明EAPGE對撲熱息痛的電化學(xué)氧化具有良好的催化作用,可用于撲熱息痛的電化學(xué)傳感。Chiavazza等[15]曾將玻碳電極在硼酸-磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)活化,并將活化電極應(yīng)用于撲熱息痛的電催化分析,其研究表明電化學(xué)活化后,碳電極表面會形成一個具有電活性的均質(zhì)粘附層,該粘附層對含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子具有良好的電催化作用。此外,電化學(xué)活化后,碳電極的表面電阻顯著降低,有利于加速電子傳遞。
采用線性掃描伏安法,考察了不同掃描速率下?lián)錈嵯⑼丛贓APGE上的電化學(xué)行為,結(jié)果如圖5A所示。在25~325 mV/s的掃速范圍內(nèi),撲熱息痛的氧化峰和還原峰電流均隨著掃速的增大而線性增加(圖5B),表明撲熱息痛在EAPGE上的電化學(xué)反應(yīng)是一個受吸附控制的過程[16]。同時,隨著掃描速率的增加,撲熱息痛的還原峰電位僅有稍許負(fù)移,與掃描速率成較差的線性關(guān)系;相反,氧化峰電位逐漸正移,且與掃描速率的自然對數(shù)呈良好的線性關(guān)系(圖5C),根據(jù)Laviron理論[17],可計算出撲熱息痛在EAPGE上的電子轉(zhuǎn)移數(shù):n=2.4≈2,與已有報道[18]一致。
圖5 (A)不同掃描速率下(由內(nèi)向外依次為:25,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325 mV/s)5.0×10-5 mol/L撲熱息痛在EAPGE上的循環(huán)伏安圖;(B)撲熱息痛氧化還原峰電流與掃速之間的線性關(guān)系圖;(C)撲熱息痛氧化還原峰電位與掃速自然對數(shù)之間的線性關(guān)系圖Fig.5 (A)Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L paracetamol on EAPGE at different scanning rates(from inner to outer the scan rate are 25,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300 and 325 mV/s,separately);(B)The linear relationship between the oxidation reduction peak currents and scan rate;(C)The linear relationship between the oxidation reduction peak potentials and the common logarithm of scan rate
圖6 (A)不同pH值的0.1 mol/L PBS中5.0×10-5 mol/L撲熱息痛在EAPGE上的循環(huán)伏安圖;(B)撲熱息痛氧化峰電流與底液pH值之間的關(guān)系;(C)撲熱息痛氧化峰電位與底液pH值之間的線性關(guān)系Fig.6 (A)Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L paracetamol on EAPGE in 0.1 mol/L PBS with different pH value;(B)The relationship between oxidation peak current and pH value;(C)The linear relationship between oxidation peak potential and pH valueScan rate is 100 mV/s.
采用循環(huán)伏安法,對底液pH值的影響進(jìn)行了考察,結(jié)果如圖6所示。底液pH值在4.0~9.0范圍內(nèi)逐漸升高時,撲熱息痛的氧化峰電流逐漸增大,pH值為7.0時達(dá)到最大,隨后逐漸減小(圖6B),故本實驗選擇7.0為檢測底液的最佳pH值。同時,撲熱息痛的氧化峰電位逐漸降低,且與底液pH值呈良好的線性關(guān)系(圖6A和圖6C),說明撲熱息痛在EAPGE上的電化學(xué)反應(yīng)過程有質(zhì)子參與。結(jié)合關(guān)系式:Ep=K-0.059(m/n)pH(式中K為常數(shù),m為反應(yīng)中轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù),n為轉(zhuǎn)移的電子數(shù))可知,當(dāng)撲熱息痛在EAPGE上發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)時,轉(zhuǎn)移質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)相同。綜上所述,撲熱息痛在EAPGE上的電化學(xué)反應(yīng)是一個兩質(zhì)子兩電子參與的準(zhǔn)可逆過程。反應(yīng)方程式推測如下:
圖7 (A)不同濃度撲熱息痛在EAPGE上的方波伏安圖。(B,C)撲熱息痛氧化峰電流與其濃度之間的線性關(guān)系圖Fig.7 (A)Square wave voltammograms of different concentrations of paracetamol on EAPGE;(B,C)The linear relationship between the oxidation peak currents of paracetamol and its concentrations
采用方波伏安法,考察了EAPGE用于撲熱息痛電化學(xué)傳感的線性范圍和檢出限,方波伏安法結(jié)果如圖7所示。隨著撲熱息痛濃度的增大,其在EAPGE上的氧化峰電流逐漸增大,且在濃度3.0×10-6~1.0×10-5mol/L(7A)及1.0×10-5~1.0×10-4mol/L(7B)范圍內(nèi),與其氧化峰電流呈良好線性關(guān)系,線性方程分別為:Ip(μA)=-2.93+2.16c(μmol/L),R2=0.99;Ip(μA)=13.05+1.08c(μmol/L),R2=0.99。當(dāng)信噪比為3時,其檢出限為9.0×10-7mol/L。
對傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進(jìn)行了考察。同一支EAPGE在空氣中放置30 d后,其對20 μmol/L撲熱息痛的電化學(xué)響應(yīng)仍能保持初始信號的92%,表明傳感器穩(wěn)定性良好。用10支EAPGE平行檢測20 μmol/L的撲熱息痛,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8.2%;用同一支EAPGE對20 μmol/L撲熱息痛平行測定10次,其RSD為4.3%,說明傳感器重現(xiàn)性良好。
取撲熱息痛緩釋片5片(含撲熱息痛0.325 g/tablet),在研缽中研碎,然后加入無水乙醇,攪拌,使其充分溶解后過濾,用無水乙醇洗滌3~4次后,轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中,用無水乙醇定容至刻度,即得待測試液。在10 mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.0)中,用微量進(jìn)樣器加入5 μL試液,按2.6節(jié)方法進(jìn)行測定,測定結(jié)果及回收率如表1所示。
表1 樣品分析結(jié)果與回收率實驗Table 1 Results of sample analysis and recovery experiment
制備了電化學(xué)活化鉛筆芯電極,其表面的均質(zhì)粘附層以及疏松多孔的結(jié)構(gòu),使得該電極對撲熱息痛的電化學(xué)反應(yīng)具有良好的催化作用,同時電化學(xué)活化使電極表面攜帶了很多含氧基團,其與撲熱息痛之間的氫鍵作用,對傳感器良好的選擇性起著關(guān)鍵的作用。該電化學(xué)傳感器具有制備簡單、線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點,可用于實際樣品中撲熱息痛含量的測定。