姚清華 李 捷 柯秋璇 顏孫安 林 虬

(1.農業(yè)農村部農產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(福州)福建福州 350003；2.福建省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所福建福州 350003；3.福建出入境檢驗檢疫局技術中心福建福州 350001)

銀耳(TremellafuciformisBerk)有“菌中之冠”的美稱，為我國著名傳統(tǒng)食藥兼用真菌[1-4]。病蟲害是影響銀耳產(chǎn)量和品質的重要因素。銀耳栽培中常見的病害是綠色木霉(Trichodermaviride)、青霉(Penicillium)、淺紅酵母菌(RhodotorulapallidLodd)、鏈孢霉(NeurosporasitophilaShear et Dadge)，蟲害則多為螨蟲、菇蚊、線蟲等[5-7]。銀耳病蟲害防治方法通常是在正式栽培前，通過對空菇房噴施農藥來進行預防的。吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鮮胺為銀耳中常見的防治病蟲害的農藥種類。

目前，關于銀耳中農藥殘留的分析，僅少量文獻報道了銀耳中單一農藥及其代謝物殘留的高效液相色譜[8，9]或氣相色譜[10]分析方法，但未涉及多種農藥殘留的同時檢測。液相色譜-串聯(lián)質譜法集高效分離、高靈敏度、多組分定性與定量于一體的優(yōu)點[11-16]。本文以乙酸乙酯提取銀耳樣品，可以同時分析銀耳中的8種常見農藥殘留量，且樣品前處理凈化步驟簡單、適用性廣。方法經(jīng)大量實際銀耳樣品的檢測分析驗證，具有快速、準確、穩(wěn)定的優(yōu)點，對其它食用菌中多種農藥殘留的同時檢測也可提供參考和借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6460三重四極桿質譜儀(美國，Agilent公司)；SYNERY UV超純水器(美國，Millipore公司)；IKA-MS3漩渦振蕩器(德國，IKA公司)；HN200氮吹儀(濟南海能儀器股份有限公司)；TDL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠)。

吡蟲啉(Imidacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、異丙威(Isoprocarb)、丁硫克百威(Carbosulfan)、克百威(Carbofuran)、甲胺磷(Methamidophos)、乙酰甲胺磷(Acephate)、咪鮮胺(Prochloraz) 8種標準物質均購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，均為100 μg/mL。正己烷、乙腈、乙酸乙酯(色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司)，NaCl(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；PSA和GCB固相萃取填料(美國Agilent公司)；C18固相萃取填料(美國Welch Material公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制移取吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷、咪鮮胺8種標準物質各1.00 mL(100 μg/mL)于10 mL容量瓶中，配制成10.0 μg/mL的混合標準儲備溶液，使用時以空白基質溶液稀釋成適當濃度的基質標準工作液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取與凈化稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，加入1 g NaCl，準確加入20 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s后，超聲提取30 min，4 000 r/min離心5 min后，將4 mL上清液轉移至另一個試管中，分別加入100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB固相萃取填料，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min離心5 min后，準確移取2 mL上清液氮吹至干，1 mL 30%乙腈水溶液定容，過0.22 μm有機濾膜后，待進樣分析。

1.2.3 液相色譜-三重四極桿質譜條件色譜條件：Phenomenex Luna C8色譜柱(150 mm×2.0 mm，3.0 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：初始為30%B，保持0.5 min；0.5～3 min，90%B；3～6 min，保持90%B；6～9 min，30%B，保持3 min。流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。質譜條件：多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測；毛細管電壓：3 500 V；氣簾氣溫度：325 ℃；氣簾氣流速：8 mL/min；鞘氣溫度：340 ℃；鞘氣流速：12 mL/min。8種待測農藥的保留時間、母離子、特征離子碎片、碰撞能量及保留時間見表1。

表1 8種農藥的LC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters for eight pesticides

*quantitative ion pairs.

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取方式選擇本實驗分別采用乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯+正己烷(50+50)對銀耳中的8種目標農藥進行提取，各農藥的回收率見圖1。結果表明，采用乙酸乙酯提取效果最好，8種農藥的回收率均在70%～120%之間，乙酸乙酯+正己烷(50+50)對甲胺磷和乙酰甲胺磷的提取回收率僅為20%左右，而乙腈對丁硫克百威的提取回收率不到30%，故選取乙酸乙酯為提取溶劑。

2.1.2 凈化方法選擇本實驗使用QuChERS方法凈化，對比了C18、GCB和PSA 3種固相萃取填料，發(fā)現(xiàn)GCB對咪酰胺，PSA對甲胺磷和乙酰甲胺磷有強吸附作用，使用這兩種固相萃取填料作為吸附劑，相應農藥的回收率較低，結果見圖2。使用C18固相萃取填料凈化，8種農藥的回收率均能達到理想值。比較凈化效果，發(fā)現(xiàn)C18能顯著降低丁硫克百威、吡蟲啉、咪酰胺等農藥的基質效應，故選擇C18作為固相萃取吸附材料。

圖1 不同提取溶劑對銀耳中8種農藥的提取效率Fig.1 Extraction efficiencies of 8 pesticides with different extraction solvents

圖2 不同凈化方法條件下銀耳中8種農藥的回收率Fig.2 Recoveries of 8 pesticides with different purification method

2.2 基質效應的考察

基質成分和目標化合物在電噴霧離子源進行離子化時會存在競爭關系，包括基質增強效應和基質抑制效應[11]。通?；|工作曲線和標準工作曲線斜率比值在85%～115%之間不存在基質效應。實驗以銀耳為基體，通過配制相應線性范圍內的標準工作曲線和基質工作曲線，對銀耳中農藥殘留分析檢測進行基質效應考察。結果表明，銀耳中吡蟲啉、啶蟲脒、克百威、咪酰胺、異丙威的基質工作曲線的斜率為標準工作曲線斜率的85%～115%之間，但是丁硫克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷的基質工作曲線的斜率為標準工作曲線斜率的40%～50%，故采用基質工作曲線來對8種農藥殘留進行定量。

2.3 色譜與質譜條件的優(yōu)化

圖3 8種農藥標準溶液(20 μg/L)(a)及空白樣品加標(20 μg/kg)(b)的總離子流(TIC)色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of eight pesticides standard(20 μg/L)(a) and spiked blank sample(20 μg/kg)(b)Left to right:peak 1,acephate;peak 2,methamidophos;peak 3,imidacloprid;peak 4,acetamiprid;peak 5,carbofuran;peak 6,isoprocarb;peak 7,prochloraz;peak 8,carbosulfan.

實驗以0.1%甲酸溶液作為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫方式洗脫，對8種農藥的準分子離子峰進行二級質譜分析，分析碎片離子信息，選擇2～3對響應值高、基線噪音值低的離子對作為定性離子對，選擇其中信號最強的定性離子對作為定量離子對。進一步對液相色譜條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當采用0.1%甲酸和5 mmol/L NH4Ac溶液替代含0.1%甲酸溶液作為流動相A后，連續(xù)對混合標準溶液進樣，目標物的線性范圍均較大且峰面積的相對標準偏差(RSD)均較小，故將流動相A改為含0.1%甲酸-5 mmol/L NH4Ac溶液。甲胺磷和乙酰甲胺磷保留時間相近，不能較好的分離，但是本文采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定性定量，方法具有良好的選擇性，克服了甲胺磷和乙酰甲胺磷定量結果間的相互影響。8種農藥的總離子流色譜圖見圖3。

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限將不同濃度的混合農藥標準溶液進行高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析，以峰面積(Y)與對應目標物濃度(X，μg/mL)繪制標準曲線，8種目標農藥的線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。在空白樣品中添加不同濃度的含8種目標物的標準溶液，按優(yōu)化條件進行測定，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限和定量限，結果亦列于表2。

2.4.2 方法準確度和精密度在空白銀耳樣品中分別添加20、100、200 ng/mL 3個不同質量濃度的待測組分混合標準溶液，按優(yōu)化后的條件重復測定6次。銀耳樣品中8種農藥的加標回收率及相對標準偏差(RSD)如表3所示。銀耳中添加不同水平8種農藥的回收率為70.1%～106.4%，RSD為3.97%～13.68%。方法具有良好的回收率和精密度，能夠滿足銀耳中8種農藥殘留量的分析要求。

表2 8種農藥的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of eight pesticides

表3 方法的加標回收率及精密度(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of eight pesticides(n=6)

2.5 方法的應用

用本文建立的方法對132份銀耳樣品進行檢測，人員及實驗室間比對結果表明該方法重現(xiàn)性好，穩(wěn)定、可靠。其中，15份樣品檢出吡蟲啉，15份樣品檢出克百威，4份樣品檢出異丙威，3份樣品檢出乙酰甲胺磷，2份樣品檢出甲胺磷，2份樣品檢出啶蟲脒，2份樣品檢出咪鮮胺，但殘留量較低。

3 結論

建立了同時測定銀耳及其栽培料中吡蟲啉、啶蟲脒、異丙威、丁硫克百威、克百威、甲胺磷、乙酰甲胺磷和咪鮮胺8種農藥的高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法。該方法樣品前處理凈化步驟簡單，快速、準確、重現(xiàn)性好，適用于銀耳中多農藥殘留的檢測。