張林田* 陸奕娜 黃學泓 林 文 李冠斯 呂堅鈴

(汕頭海關檢驗檢疫技術中心廣東汕頭 515041)

獸藥殘留是指動物在使用了獸藥后，其蓄積或儲存在動物細胞、組織或器官內(nèi)的藥物原型、有毒性的代謝物或雜質(zhì)，所以監(jiān)控不同種類的獸藥在動物源性產(chǎn)品中的殘留是確保食品安全的有效手段。但是目前獸藥殘留分析的標準方法一般只能分析化學結構類似的同族藥物[1-4]，因此，建立多種類、多獸藥殘留的分析方法具有很強的實用意義。

磺胺類(SAs)藥物是具有對氨基苯磺酰胺結構的一類抗生素的總稱，用于預防和治療細菌感染性疾病，因具有療效好、抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉等優(yōu)點而被廣泛應用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。磺胺增效劑是指含有5-取代芐基-2，4-二氨基嘧啶的一類化合物，為廣譜抑制劑，多與磺胺合用，使細菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，抗菌作用可增強數(shù)10倍[5]。喹諾酮類(QNs)藥物是人工合成的含有吡酮酸(1，4-二氫-4-氧吡啶-3-羧酸)基本結構的一類藥物，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強、價格低廉等特點，是獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于預防和治療動物疾病及促生長。獸藥的過量使用可導致細菌產(chǎn)生抗藥性,其殘留會通過食物鏈對人體產(chǎn)生直接毒副作用。世界各國都規(guī)定了獸藥在動物源性食品中的最大殘留限量，我國規(guī)定動物源性食品中SAs的最高殘留限量為100 μg/kg，磺胺增效劑(三甲氧芐氨嘧啶)為50 μg/kg，豬肌肉中恩諾沙星為100 μg/kg[6]。本文建立了通過式凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中SAs、磺胺增效劑及QNs共42種獸藥殘留，方法具有簡單、快捷、靈敏度高、定性準確等特點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API4000 plus型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB公司);30AD系列高效液相色譜儀(日本，島津公司)；IKA T25數(shù)顯型高速分散機(德國，IKA公司);Eppendorf 5810R冷凍高速離心機(德國，Eppendorf公司);MGS-2200型氮吹濃縮儀(日本，東京理化公司)。

45種藥物標準品的純度在93.0%～99.0%范圍內(nèi)，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，使用時按實際成分進行折算。42種獸藥及3種內(nèi)標(具體名稱見表1)標準儲備溶液：取適量標準品，用甲醇溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的標準儲備溶液，置棕色容量瓶中，于-18 ℃避光保存。使用時用甲醇稀釋成濃度為1.0 mg/L的混合標準使用液。甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA公司);甲酸(色譜純，美國TEDIA公司);提取液(0.1%甲酸乙腈)：吸取1 mL HAc，轉(zhuǎn)移入1 000 mL容量瓶，用乙腈定容并搖勻；0.1%甲酸溶液:準確吸取1 mL甲酸，轉(zhuǎn)移入1 000 mL容量瓶，用水定容并搖勻，作為本實驗的流動相；溶解液：乙腈-0.1%甲酸水溶液(20∶80，V/V)。實驗用水為(GB/T6682)規(guī)定的一級水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取準確稱取5 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入約5 g無水Na2SO4、12 mL乙腈-1%甲酸溶液、100 μL 1.0 mg/L同位素內(nèi)標混合液，12 000 r/min均質(zhì)提取30 s后，振蕩15 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液。取12 mL 0.1%甲酸乙腈洗滌刀頭10 s，洗滌液倒入殘渣，用玻棒攪散，旋渦1 min，振蕩提取15 min，4 000 r/min離心5 min，合并上清液，用提取液定容至25.0 mL。

1.2.2 提取液凈化PRiME HLB固相萃取柱置于固相萃取裝置上，取樣品提取液5 mL過柱，自然滴出，滴干后用0.8 mL乙腈-甲醇(9+1)淋洗小柱兩次，收集全部流出液于10 mL試管中，40 ℃氮氣吹干，加入1.0 mL樣品溶解液，旋渦混合3 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.3 空白基質(zhì)標準溶液的制備稱取7份陰性樣品5 g，分別加入0.5 mg/L混合標準溶液0、10、50、100、200、500、1 000 μL及100 μL 1.0 mg/L同位素內(nèi)標溶液，以下按“1.2.1”及“1.2.2”操作步驟進行。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件Waters Atlantis T3色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm；美國Waters公司),流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液。流動相梯度洗脫程序為:起始20%A；0～15 min,線性升至30%A；15～21 min,線性升至70%A,保持4 min；0.2 min降至20%A，保持3.8 min。柱溫30 ℃；流速400 μL/min；進樣體積10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧電離正離子(ESI+)模式；動態(tài)多反應監(jiān)測(dMRM)模式檢測;霧化氣壓力(GSI):60 psi；輔助氣壓力:50 psi；氣簾氣壓力(CUR):25 psi；離子源溫度:600 ℃;電噴霧電壓(IS):5 500 V;MS1及MS2均為Unit單位分辨率;碰撞氣壓力(CAD):6 psi；MRM檢測窗口:120 s；化合物掃描時間:2 s。42種藥物及3種同位素內(nèi)標的dMRM質(zhì)譜相關參數(shù)見表1。

表1 42種獸藥的動態(tài)多反應監(jiān)測(dMRM)離子對及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Dynamic multiple reaction monitoring transition and mass spectrometry parameters of representative compounds within 42 veterinary drugs

(續(xù)表1)

Drug Molecular formulaPrecusorion(m/z)Production(m/z)DP(V)CE(eV)tR(min)Fleroxacin(FLE)C17H18F3N3O3370.1326.1?/269.18027/364.1Nalidixicacid(NAL)C12H12N2O3233.0215.0?/187.02119/3521.4Marbofloxacin(MAR)C17H19FN4O4363.172.0?/320.18046/233.9Enrofloxacin-D5(ENR-D5)C19H18D5CLFN3O3365.3321.3100324.9Sulfanilamide(SA)C6H8N2O2S173.0156.0?/108.03010/214.2Sulfaguanidine(SG)C7H10N4O2S215.0156.0?/92.05215/313.7Sulfadiazine(SD)C10H10N4O2S251.1156.0?/92.16322/386.1Sulfapyridine(SPD)C11H11N3O2S250.1156.0?/108.06523/346.7Sulfathiazole(STZ)C9H9N3O2S2256.1156.1?/92.16022/376.1Diaveridine(DVD)C13H16N4O2261.2245.3?/123.16535/333.7Sulfamerazine(SMR)C11H12N4O2S265.1156.1?/172.07324/247.7Sulfamethazine(SMTZ)C11H12N4O3S279.1186.0?/124.17525/353.9Trimethoprlm(TMP)C14H18N4O3291.1230.1?/123.19533/343.8Sulfacetamide(SAM)C8H10N2O3S215.0156.0?/92.05215/315.7Sulfadiazine-13C6(SDZ-13C6)#C413C6H10N4O2S257.1162.160236.1Sulfameter(SMT)C11H12N4O3S281.0156.0?/126.17525/259.1Sulfadimidine(SDM)C12H14N4O2S279.1124.1?/1867527/359.1Sulfamonomethoxine(SMM)C11H12N4O3S281.0156.0?/126.17525/2711.3Sulfamethoxypyridazine(SMPD)C11H12N4O3S281.0156.0?/126.17525/279.5Sulfamethoxazole(SMZ)C10H11N3O3S254.1156.0?/108.07023/3214.4Sulfamoxol(SMXL)C11H13N3O3S268.1156.0?/113.17021/237.8Sulfabenzamide(SBZ)C13H12N2O3S277.1156.0?/108.16019/3218.8Sulfachloropyridazine(SCP)C10H9CLN4O2S285.1156.0?/92.16532/2212.6Sulfaquinoxaline(SQX)C14H12N4O2S301.1156.1?/92.18024/4119.6Sulfadoxine(SDX)C12H14N4O4S311.0156.1?/108.18031/3814Sulfaphenazole(SPA)C15H14N4O2S315.0156.0?/222.18429/2819.9Sulfisoxazole(SFZ)C11H13N3O3S268.1156.0?/113.17021/2316.0Sulfadimethoxine(SDM)C12H14N4O4S311.0156.0?/108.18031/3819.5Sulfamethizol(SMTZ)C9H10N4O2S2271.0156.1?/108.06521/368.8Sulfanitran(SNT)C14H13N3O5S336.1294.1?/198.16519/2221.8Sulfadimethoxine-D6(SDM-D6)#C12H8D6N4O4S317.0156.0852919.5

*Quantitative ion;#Isotope internal standard.

1.4 測定方法

取樣品溶液和混合標準溶液各10.0 μL進行測定，以其標準溶液峰的保留時間和MRM兩對質(zhì)譜監(jiān)測離子對為依據(jù)進行定性分析，以定量離子對的峰面積和相應內(nèi)標物的峰面積的比值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制工作曲線，以工作曲線比較定量，計算相應待測物的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

QNs結構中含有叔胺基，與色譜填料中的殘余硅醇基和金屬離子產(chǎn)生氫鍵或離子交換作用，造成峰形拖尾、展寬，保留時間漂移等現(xiàn)象，該現(xiàn)象成為獸藥多殘留分析時色譜條件優(yōu)化的難點[7]。文中所涉及的42種獸藥屬于中等極性或極性較弱的化合物，選用5款反相色譜柱進行比較：Thermo Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm,1.9 μm)、Waters Attantis T3柱(100 mm×4.6 mm,3 μm)、Waters Attantis dC18柱(100 mm×2.1 mm,5 μm)、CAPCELL MGⅡ C18柱(150 mm×2.0 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Ag C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm))，發(fā)現(xiàn)Waters Attantis T3色譜柱可有效克服QNs色譜峰拖尾。這可能是該色譜柱采用專有的鍵合和封端技術，能夠?qū)⒏嗟挠坞x硅羥基反應完全。

用作液-質(zhì)分析的有機流動相，大都采用甲醇或乙腈，當采用甲醇作為流動相時，有部分極性較弱的藥物如萘啶酸、氟甲喹需很長時間才洗脫出來，為縮短分析時間，采用乙腈作為流動相中的有機相。這42種獸藥均為[M+H]+的模式，為提高電離效率，增加目標物的響應值，選擇在流動相的水相中增加適量甲酸。在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著甲酸濃度增加，各目標分析物的離子對色譜峰響應降低，噪音增大，這可能與藥物的準分子離子峰穩(wěn)定性及離子化效率有關，經(jīng)比較最終確定流動相體系中甲酸濃度為0.1%。42種藥物極性各不相同，與色譜柱的親和力不同，為更好的將藥物分離，采用梯度洗脫方式，針對反相色譜柱，首先用高比例的水相(80%)和低比例的有機相(20%),使極性較強的目標物被洗脫出來，先采用較緩梯度使目標物中的同分異構體，特別是SMT、SMPD和SMM三種同分異構體達到基線分離，接著采用較陡梯度，提高有機相的比例至70%，使極性較弱的目標物盡早出峰，縮短分析時間。在該色譜分離條件下，目標物中具有相同母離子和子離子的6組同分異構體都能得到基線分離，特別是SMT、SMM和SMPD，峰形尖銳、峰寬較窄，各藥物保留時間穩(wěn)定，從3.8 min始至21.9 min結束，出峰分布較均勻，確保了質(zhì)譜在合適的掃描范圍內(nèi)各色譜峰都有10個以上掃描點數(shù)，各目標物得到最佳靈敏度。

在優(yōu)化的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下，42種藥物總離子流圖及6種同分異構體的提取離子流圖見圖1。

圖1 混合基質(zhì)標準溶液的總離子流(TIC)色譜圖和6種同分異構體的提取離子流(EIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of mixed matrix-standard solution and EIC chromatograms of six isomers

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)待測物的化學結構，42種待測物均適合在ESI+模式下進行離子化，母離子均為[M+H]+。將42種標準品儲備液用甲醇稀釋成濃度為1.0 mg/L的標準使用溶液。在ESI+模式下，分別對待測物進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。先根據(jù)藥物的相對分子質(zhì)量通過選擇離子監(jiān)測優(yōu)化去簇電壓(DP)使[M+H]+的響應最大，再以其為母離子，對其子離子進行MS2掃描分析，通過優(yōu)化碰撞能量(CE)使得子離子的響應最大，挑選靈敏高、干擾小的二對離子，得到MRM離子對及相應質(zhì)譜采集參數(shù)。另外，為了減少樣品中雜質(zhì)對離子源及真空系統(tǒng)的污染，本實驗在進入質(zhì)譜前采用了類似溶劑延遲的功能，色譜柱流出液經(jīng)六通閥切換至廢液中，2.5 min后切換至質(zhì)譜中采集數(shù)據(jù)，第23.0 min時六通閥又將柱流出液切換至廢液中，這使得極性較強和極性較弱的雜質(zhì)都被切換至質(zhì)譜儀之外。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

由于乙腈是極性溶劑，可以避免從動物組織中提取出過多的脂肪，同時乙腈具有很好的蛋白沉淀效果和共提物少的特點，可沉淀樣品中99%的蛋白，乙腈在獸藥殘留檢測時被廣泛運用[1-5]。本方法選擇乙腈作為提取溶劑。磺胺類藥物有酸堿兩性，在不同的溶劑中均有一定的溶解性；喹諾酮類藥物在酸性提取溶劑下，更易被萃取。經(jīng)實驗比較，提取液中加入0.1%的甲酸可達到較理想的回收率。

動物源性產(chǎn)品中含大量磷脂，極大干擾目標化合物的分析，降低色譜柱壽命、增大儀器系統(tǒng)的維護成本和難度。本方法采用通過式Oasis PRiME HLB固相萃取(SPE)小柱凈化樣品，相比保留式SPE凈化小柱，無須活化、平衡、上樣、洗滌、洗脫步驟，可大幅縮短實驗時間，避免在上樣及淋洗過程中產(chǎn)生的吸附不完全導致穿透而使目標物損失[8]，避免樣品堵塞柱子。通過掃描m/z184的母離子，得到近似磷脂類化合物的含量信息。圖2比較了經(jīng)PRiME HLB凈化前后的空白豬肉樣品的凈化效果。說明樣品經(jīng)PRiME HLB凈化后，可去除99%磷脂類化合物的干擾。

圖2 PRiME HLB凈化前后的空白豬肉樣品效果比較Fig.2 Comparison of blank pork samples before(a) and after(b) PRiME HLB purification

2.4 線性方程與檢出限

在選定的色譜分離條件和質(zhì)譜測定參數(shù)下，測定7個水平的基質(zhì)匹配工作溶液系列，以目標物峰面積與內(nèi)標物峰面積之比為縱坐標，以目標物的質(zhì)量濃度(μg/kg)為橫坐標做工作曲線，得到線性回歸方程，42種藥物回歸方程的相關系數(shù)在0.9978～0.9999之間，表明各藥物在相應的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。空白樣品中添加已知濃度的藥物標準品工作液，添加濃度依次降低，按照方法規(guī)定的步驟進行檢測，以能達到信噪比(S/N)>3時樣品的濃度為檢測限(LOD)，定量離子色譜峰信噪比(S/N)>10為方法定量限，結合藥物的最大殘留限量(MRL)，確定檢測限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

取豬肉樣品，按2.0、4.0、10.0 μg/kg濃度水平添加標準溶液，每個樣品均按本方法做6次平行測定，結果見表2。各藥物的平均回收率為81.1%～115.9%，相對標準偏差(RSD)為6.8%～22.1%，符合有關法規(guī)的要求。

表2 樣品中42種藥物的回收率和相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of 42 kinds of drugs in the sample(n=6)

(續(xù)表2)

Spiked(μg/kg)DrugRecovery(%)RSD(%)DrugRecovery(%)RSD(%)DrugRecovery(%)RSD(%)2NOR98.412.3MAR95.014.6SMPD92.819.04101.08.6115.910.398.215.21098.512.2102.513.1102.79.22ENO93.215.1SA105.615.7SMZ99.319.9489.811.997.113.489.816.21099.68.396.19.199.213.72CIP104.215.3SG84.612.4SMXL101.914.7497.512.292.813.586.614.710111.16.4105.012.9103.110.12PEF97.88.8SD101.314.2SBZ95.110.9499.015.686.913.0106.215.710100.67.595.110.092.413.12LOM90.89.1SPD115.813.1SCP102.122.1498.411.693.49.499.011.51099.912.790.98.998.313.42DNA85.216.6STZ99.514.5SQX97.412.1495.410.5101.211.895.314.31098.57.797.57.387.718.72ENR97.015.2DVD86.212.3SDX98.18.74100.013.094.310.596.314.31097.49.8104.511.6105.29.32OFL97.814.3SMR81.114.5SPA102.315.34100.815.786.510.6102.215.41093.711.788.47.696.213.72SARA93.814.9SMTZ103.520.1SFZ98.89.64102.815.586.115.5100.115.210100.46.897.98.296.213.02SPAR100.211.2TMP101.915.3SDM118.511.24108.711.397.514.997.517.81099.69.991.09.091.212.02ORB93.614.0SAM102.012.2SMTZ94.522.04108.714.696.318.392.520.91096.58.795.68.996.812.22DIF95.215.6SMT98.917.2SNT81.321.34109.013.5101.911.586.918.910102.512.2104.46.1114.216.3

2.6 與標準方法比較

取已知含量的質(zhì)控樣品，按本法規(guī)定步驟檢測磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑和恩諾沙星，結果見表3。本法的測定值與真實值的含量偏差符合實驗室質(zhì)量控制規(guī)范(GB/T27404)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 理化檢測》[9]的要求，說明本法與國家標準方法無差異性。

表3 質(zhì)控樣品測定結果(μg/kg)Table 3 Determination results of quality control sample (μg/kg)

3 結論

本實驗以蝦等動物源性食品為對象，建立了通過式凈化-HPLC-MS/MS同時測定動物源性食品中的3類共42種獸藥殘留的分析方法。經(jīng)實際樣品檢測，方法簡便、快捷、準確，解決了標準檢測方法存大的檢測項目少、時間長、前處理繁、成本高等不足，適用于動物源性食品中獸藥多殘留的快速篩查檢測。