劉 俊 楊 飛 粟有志 李 芳 李艷美

(1.中華人民共和國烏魯木齊海關新疆烏魯木齊 830063；2.新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院新疆烏魯木齊 830011；3.中華人民共和國伊寧海關新疆伊寧 835000)

葡萄干富含葡萄糖、有機酸、多酚等多種營養(yǎng)成分，對人體的心血管疾病及代謝疾病有一定的保健功效[1]。農(nóng)藥是防治葡萄病蟲害的主要技術手段，其伴隨葡萄的生產(chǎn)過程而可能殘留于葡萄干中。我國國家標準(GB 2763-2016)規(guī)定了苯丁錫、蟲酰肼、聯(lián)苯肼酯等17種農(nóng)藥在葡萄干中的最大殘留限量(MRLs)[2]，同時歐盟、國際食品法典委員會(CAC)、日本、美國等國家或組織也均對葡萄干中的農(nóng)藥殘留設定了嚴格的MRLs[3]。

目前，多農(nóng)藥殘留的檢測主要采用氣相色譜法[4，5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6，7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8，9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10，11]等方法，常用于分析新鮮果蔬、中草藥和茶葉等樣品。文獻報道的葡萄干中多農(nóng)藥殘留的檢測方法以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為主。李海艷等[12]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了葡萄干中27種農(nóng)藥殘留；張婷亭等[13]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄干等干果果肉中56種農(nóng)藥殘留；粟有志等[14]建立了葡萄干中105種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。而采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法分析葡萄干中的多農(nóng)藥殘留鮮有報道。本研究采用改進的QuEChERS前處理方法，結(jié)合GC-MS/MS法建立了葡萄干中常用80種農(nóng)藥的分析方法。該方法操作簡便快捷、精密度和回收率較好，適合于葡萄干中多農(nóng)藥殘留的定量測定及確證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-7000C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent公司)；N-EVAP-112水浴氮吹儀(Organomation公司)；Sigma3-18K臺式冷凍離心機(Sigma公司)；MS3型渦旋振蕩器(IKA公司)；GM200刀式混合研磨儀(Retsch公司)。

80種農(nóng)藥標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、乙酸均為色譜純，其他試劑為分析純。乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)粒徑40～60 μm、苯磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)粒徑40～60 μm、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)粒徑70～90 μm(Agela公司)；酸性氧化鋁(ALA)、石墨化炭黑(GCB)和C18、氨基(NH2)粉(Agilent公司)。實驗用水為Milli-Q(Millipore公司)超純水。

實驗所用葡萄干樣品來自市場隨機采樣和送檢樣品。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取各農(nóng)藥標準品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，儲存于-18 ℃冰箱中。分別取上述單標準儲備液，用正己烷-丙酮(1∶1，V/V)稀釋定容，配制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量濃度均為5.0 mg/L的混合標準工作溶液，儲存在4 ℃冰箱中備用。取混合標準工作溶液用正己烷-丙酮(1∶1，V/V)稀釋，配制1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/L的系列標準溶液。

1.3 樣品前處理

取代表性樣品500 g，置于-20 ℃冰箱放置6 h以上，待樣品中水分凍成固態(tài)冰后，迅速取出用組織搗碎機加工成粉末狀，混勻，密封，作為試樣，標明標記。稱取2 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入6 mL水，放置30 min。加入10 mL 1%乙酸乙腈(1∶99，V/V)，加入1.5 g NaCl，10 000 r/min均質(zhì) 1 min，加入2 g NaCl，渦旋30 s，8 000 r/min離心1 min，取上清液6 mL于15 mL具塞離心管中，加入PSA和PEP各100 mg；加入0.2 g無水MgSO4，渦旋30 s，8 000 r/min離心1 min，取5 mL上清液于15 mL試管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL丙酮-正己烷(5∶5，V/V)溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜，濾液待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：HP-5MS UI柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；色譜柱升溫程序：80 ℃(保持1 min)，以25 ℃/min升溫至150 ℃，以5 ℃/min速率升溫到200 ℃(保持2 min)，以10 ℃/min升溫至280 ℃(保持6 min)。載氣：高純He(純度>99.999%)；柱流量：1.2 mL/min；進樣方式：無分流進樣；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：260 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件電子轟擊(EI)電離，電離能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；碰撞氣：氬氣(純度99.999%)；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測；溶劑延遲4 min。80種農(nóng)藥的名稱、保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 80種農(nóng)藥的保留時間及優(yōu)化的GC-MS/MS參數(shù)Table 1 Retention times and optimized GC-MS/MS conditions for 80 pesticides

(續(xù)表1)

No.CompoundtR(min)Parention/Production(m/z)(Collisionenergy/eV)No.CompoundtR(min)Parention/Production(m/z)(Collisionenergy/eV)16Atrazine10.79215.0/200.0(5),215.0/58.0?(20)56Paclobutrazol17.44236.0/125.0?(20),125.0/89.0(25)17Propazine10.93229.0/58.0?(20),214.0/172.0(10)57Flutriafol17.86219.0/123.0?(25),219.0/95.0(35)18Gamma-HCH11.06219.0/183.0?(10),219.0/147.0(25)58Isoprothiolane18.32162.0/85.0?(25),118.0/90.0(15)19Quintozene11.22265.0/237.0?(18),237.0/143.0(30)59Profenofos18.37337.0/267.0(15),208.0/63.0?(35)20Terbufos11.25231.0/175.0(15),231.0/128.9?(25)60Dieldrin18.42277.0/241.0(10),263.0/193.0?(35)21Propyzamide11.35173.0/145.0?(15),173.0/109.0(15)61Pretilachlor18.49162.0/147.0(10),162.0/132.0?(20)22Pyrimethanil11.51198.0/183.0?(20),198.0/158.0(25)62Tribufos18.49202.0/147.0(5),169.0/57.0?(20)23Diazinon11.67304.0/179.0?(10),179.0/137.0(20)63Oxadiazon18.68258.0/175.0(5),175.0/112.0?(15)24Disulfoton11.78142.0/109.0(10),125.0/97.0?(5)64Myclobutanil18.73179.0/152.0(5),179.0/125.0?(15)25Triallate12.07268.0/226.0(20),268.0/184.0?(20)65Buprofezin18.81305.0/172.0(10),172.0/57.0?(10)26Phosphamidon12.90127.0/109.0?(15),127.0/95.0(20)66Flusilazole18.83233.0/165.0?(20),233.0/152.0(20)27Acetochlor13.12223.0/147.0(10),223.0/132.1?(25)67Orthosulfamuron19.00116.0/89.0?(15),116.0/63.0(35)28Chlorpyrifos-methyl13.17286.0/208.0(10),286.0/93.0?(10)68Endrin19.05263.0/193.0?(35),263.0/191.0(35)29Parathion-methyl13.18263.0/109.0?15),263.0/79.0(15)694,4′-DDT19.67237.0/165.1(30),235.0/165.1?(30)30Vinclozolin13.18285.0/212.0?(15),285.0/198.0(30)702,4-DDT19.73237.0/165.1(30),235.0/165.1?(30)31Heptachlor13.37272.0/236.9?(20),272.0/235.0(20)71Benalaxyl20.43148.0/105.1(15),148.0/79.0?(32)32Metolachlor13.44238.0/162.1?(12),162.0/133.1(15)72Quinoxyfen20.49272.0/237.0(20),237.0/208.0?(30)33Alachlor13.44188.0/160.1?(10),160.0/132.1(12)73Tebuconazole20.97250.0/125.0?(32),250.0/70.0(10)34Ametryn13.48227.0/185.1?(5),227.0/170.1(12)74Piperonylbutoxide21.26176.0/131.1(10),176.0/103.1?(20)35Metalaxyl13.63206.0/132.0?(20),206.0/105.0(25)75Bromopropylate21.84343.0/185.0(25),341.0/183.0?(25)36Fenitrothion14.13277.0/260.1(5)?,277.0/109.0(25)76Bifenthrin21.96181.0/166.0(15),181.0/165.0?(30)37Pirimiphos-methyl14.24290.0/233.0(15),290.0/125.0?(25)77Phosalone22.65147.0/132.0(15),147.0/117.0?(20)38Dichlofluanid14.38224.0/123.0?(15),167.0/124.0(10)78Fenarimol23.21251.0/139.0(15),219.0/107.0?(15)39Aldrin14.55263.0/227.9(25),263.0/192.9?(35)79Pyridaben24.04367.0/182.0(10),182.0/111.0?(20)40Malathion14.57173.0/127.0(5),173.0/99.0?(15)80Etofenprox25.41163.0/135.0(10),163.0/107.0?(20)

*quantification transition.

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥種類的選擇

本文選擇食品安全國家標準(GB 2763-2014)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》所規(guī)定的葡萄干中的限量農(nóng)藥，以及葡萄生產(chǎn)過程中經(jīng)常使用的農(nóng)藥作為分析對象，最后選擇適宜于GC-MS/MS分析的80種農(nóng)藥作為研究對象。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

首先對農(nóng)藥單一標準溶液(濃度為10 mg/L)在m/z50～500之間進行全掃描，確定分析物一級質(zhì)譜圖和保留時間。從一級質(zhì)譜圖中選擇靈敏度高、質(zhì)荷比較大(m/z>100)的離子初步定為母離子。對選定的母離子用子離子掃描的方式，確定二級質(zhì)譜圖，從中選擇信號較高的離子作為子離子。對每一組母離子/子離子，分別選擇碰撞能量為5、10、15、20、25、30、35、40 eV進行掃描，以響應信號強弱為依據(jù)對碰撞能量進行優(yōu)化；以此優(yōu)化的碰撞能量為基礎進行微調(diào)，得到最優(yōu)的碰撞能量。根據(jù)分析物的保留時間將掃描分為9個掃描窗口，調(diào)整每個時間段內(nèi)的離子對掃描時間，保證每個分析物色譜峰的采集點數(shù)量在20個點左右，并且響應值滿足要求。80種農(nóng)藥標準品的母離子、子離子及碰撞能量見表1。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇由于葡萄干水分含量較少，用提取溶劑直接提取樣品中農(nóng)藥時，回收率較差。本文選擇先用水浸泡樣品，使樣品基質(zhì)分散從而保證回收率。本文考察了正己烷-丙酮(1∶1，V/V)、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、乙酸-乙腈(1∶99，V/V)、10 mL乙酸-乙腈7種提取溶劑對80種農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果見表2。由表2可知乙酸-乙腈+NAc體系的提取效果較好。

表2 不同提取溶劑對葡萄干中80種農(nóng)藥的添加回收率結(jié)果(n=3)Table 2 The recoveries of 80 pesticide residues in raisin by using different extraction solvents

2.3.2 吸附劑的選擇傳統(tǒng)的QuEChERS前處理一般選擇PSA、C18和GCB作為吸附劑凈化樣品。本文比較了C18、GCB、NH2、PCX、PEP、PSA、ALA 7種吸附劑對樣品的凈化效果。7種吸附劑的用量均為200 mg，結(jié)果表明C18凈化時，四氯硝基苯、甲基嘧啶磷、丁苯嗎啡、氟菌唑、噻嗪酮5種農(nóng)藥的回收率小于60%；GCB凈化時，四氯硝基苯、西瑪津、五氯硝基苯等17種農(nóng)藥的回收率小于60%；NH2凈化時，苯氟磺胺、惡草酮回收率小于60%；PCX凈化時，四氯硝基苯、二苯胺、西瑪津等21種農(nóng)殘回收率不能滿足要求；ALA凈化時，乙拌磷、氯苯嘧啶醇的回收率小于60%；PEP和PSA時，80種農(nóng)藥的回收率均可滿足方法學的要求。故本文將傳統(tǒng)QuEChERS前處理的PSA、C18和GCB填料改為PEP和PSA，選擇二者共同凈化樣品。經(jīng)凈化的空白葡萄干、空白葡萄干加標樣品的色譜圖見圖1。

圖1 空白葡萄干樣品(A)和空白葡萄干樣品中添加20 μg/kg農(nóng)藥標準(B)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of a negative raisin sample(A)and a negative raisin sample spiked mixed pesticide standard solution at 20 μg/kg(B)Nos.1-80 are the same as Table 1.

2.4 線性關系、檢出限和定量限

實驗發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對大部分的農(nóng)藥有一定的抑制或增強作用，而采用基質(zhì)匹配標準曲線可有效消除樣品基質(zhì)效應?？瞻讟悠钒凑?.3前處理，配制質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準溶液。以峰面積(y)對農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(x)作線性回歸，繪制標準曲線，80種農(nóng)藥在葡萄干基質(zhì)中的相關系數(shù)均大于0.991。按照信噪比(S/N)≥3確定方法的檢出限(LOD)，其范圍為0.2～6.2 μg/kg；以S/N≥10確定方法的定量限(LOQ)，其范圍為0.6～20.5 μg/kg。80種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標準曲線線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限詳見表3。

2.5 加標回收率和精密度

選擇葡萄干空白樣品，以20、50、100 μg/kg為加標水平進行回收率實驗。添加了農(nóng)藥混合標準溶液的空白樣品，靜置60 min，然后按照1.3和1.4進行前處理和儀器測定，每個水平重復6次?；厥章屎拖鄬藴势钜姳?。從表3可以看出，80種農(nóng)藥的回收率在62.5%～116.6%之間，相對標準偏差(RSD)為3.3%～15.4%。該方法的準確度高，精密度好，通用性強。

表3 80農(nóng)藥在葡萄干基質(zhì)中的標準曲線線性范圍、相關系數(shù)、回收率、相對標準偏差、檢出限和定量限(n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficient(r2),recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LOD) and limits of quantification(LOQ) of 80 pesticides in raisin(n=6)

(續(xù)表3)

CompundLinearrange(μg/L)r220μg/kg50μg/kg100μg/kgRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)LOQLODTetraconazole5-5000.998194.98.976.14.095.98.11.44.5Cyprodinil10-5000.998894.49.775.86.678.67.72.99.8Pendimethalin10-5000.9995114.77.781.311.088.34.62.89.4Penconazole10-5000.999185.96.381.57.8108.34.31.96.3Phenthoate5-5000.9993112.44.669.13.4101.19.71.13.8Procymidone5-5000.999594.811.081.310.8106.84.81.44.8Triflumizole20-5000.998693.410.5105.05.280.310.46.020.1Methidathion5-5000.999576.24.081.011.4114.36.91.55.0Paclobutrazol5-5000.9991106.13.4104.06.986.76.91.65.3Flutriafol5-5000.9991112.514.699.06.689.68.61.44.5Isoprothiolane10-5000.9995105.910.497.64.885.610.32.68.7Profenofos2-5000.997998.710.8101.14.195.18.70.92.9Dieldrin2-5000.9991101.012.4103.33.4104.66.90.82.8Tribufos2-5000.999198.67.297.17.1103.810.31.03.3Pretilachlor10-5000.999299.014.598.05.4101.47.42.99.8Oxadiazon2-5000.9993105.814.0105.24.8116.612.50.51.5Myclobutanil20-5000.9989100.911.199.49.487.76.24.515.0Buprofezin5-5000.998775.69.279.67.983.47.71.54.9Flusilazole5-5000.998997.57.696.36.392.411.21.44.5Orthosulfamuron10-5000.999082.33.682.15.984.36.72.99.5Endrin20-5000.999186.14.279.35.492.68.26.220.54,4′-DDT10-5000.996595.74.992.810.082.15.42.99.62,4-DDT5-5000.999794.27.194.09.686.78.11.54.9Benalaxyl20-5000.9995100.110.6105.46.080.15.95.518.3Quinoxyfen10-5000.998891.28.795.36.467.09.92.99.6Tebuconazole20-5000.998190.76.893.54.676.07.85.919.6Piperonylbutoxide20-5000.995599.08.582.29.587.54.14.816.0Bromopropylate5-5000.999498.43.394.010.182.97.11.55.0Bifenthrin20-5000.9989102.73.583.710.385.43.55.518.2Phosalone20-5000.9981102.55.195.17.685.14.45.618.5Fenarimol20-5000.9979102.05.879.37.098.07.15.317.8Pyridaben20-5000.9952106.45.699.24.168.06.65.919.7Etofenprox20-5000.999487.45.891.13.681.36.86.120.3

2.7 樣品的測定

利用本文建立的分析方法對市售的50份葡萄干樣品進行檢測，農(nóng)藥的檢出率為14.0%。5種農(nóng)藥被檢出：戊菌唑(2批)、甲霜靈(2批)、氯苯嘧啶醇(1批)、特丁硫磷(1批)、馬拉硫磷(1批)，但均未超出國內(nèi)外最大允許殘留限量值。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS前處理，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法測定葡萄干中80種農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法的準確度和精密度符合殘留分析的方法學要求，基本滿足歐盟及美國、日本等國的限量要求，適用于葡萄干中多農(nóng)藥殘留的檢測。