王 娜，隋海娟，符麗娟

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000; 2.朝陽(yáng)市第二醫(yī)院藥劑科，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

糖尿病心肌病是糖尿病患者主要的心臟并發(fā)癥，心肌間質(zhì)纖維化為其主要病理改變，也是引起糖尿病心室重塑導(dǎo)致心力衰竭的關(guān)鍵原因；其表現(xiàn)為心肌間質(zhì)細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)分化，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過(guò)度沉積等。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的重要途徑，與肺、肝臟及腎臟等多臟器纖維增生性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-3]；Wnt/β-catenin通路的激活也參與了糖尿病心臟重構(gòu)的病理過(guò)程[4]。目前，針對(duì)Wnt/β-catenin通路抑制劑的研究已成為防治纖維化相關(guān)疾病藥物研究的重要靶點(diǎn)。丹酚酸 B(salvianolic acid B，Sal B)是用于心血管系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)中藥丹參的主要活性成分，基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)[5,6]其對(duì)多種心血管損傷具有一定保護(hù)作用，如心肌缺血/再灌注損傷、2型糖尿病小鼠心肌病變等。但有關(guān)Sal B對(duì)糖尿病心肌纖維化的具體作用目前尚不明確，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)，高糖誘導(dǎo)模擬糖尿病高糖狀態(tài)，基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，觀察Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo)CFs增殖及轉(zhuǎn)分化的影響，探討Sal B對(duì)糖尿病心肌間質(zhì)纖維化的作用及可能機(jī)制，為傳統(tǒng)中藥防治糖尿病心肌病變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物、藥品與試劑 1～3 d齡新生SD大鼠乳鼠(錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(遼)2016-0004。Sal B(美侖MB6598)；Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939(APEX BIO A1877)。DMEM培養(yǎng)基(Mediatech公司)；增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(上海尚寶生物科技有限公司)；α-SMA抗體(博士德公司W(wǎng)L02509)；β-catenin抗體(abcam公司ab32572)；p-GSK 3β 抗體(abcam公司ARG51777)。

1.1.2儀器 CO2孵箱(三洋公司)；相差顯微鏡(Olympus公司)； Mini-REPOTEANⅡ型電泳槽、電泳儀、Semi-dry Transfer cell(Bio-Red公司)；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(日立公司)；Biocell 2010酶標(biāo)儀(Anthos Labtec Instruments公司)；數(shù)顯氣浴恒溫震蕩器(江蘇CHA-SA)；化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀(美國(guó)UVP公司)；Leica 4000B正置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1CFs分離與培養(yǎng) 新生SD大鼠乳鼠，♀ ♂不拘，體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒，取出心臟，冷PBS沖洗2次，放于冷培養(yǎng)基中，剪約1 mm3組織碎塊，加入0.25% 胰酶37 ℃水浴中進(jìn)行消化。將消化的上清加至含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中終止消化。將收集的細(xì)胞1 000×g離心10 min，棄去上清。向沉淀中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，吹打均勻，制成細(xì)胞懸液。剩余組織繼續(xù)按上述操作消化至組織消化完全，之后將細(xì)胞懸液均勻接種于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2孵箱。差速貼壁90 min后，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞3次，更換新的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)近融合狀態(tài)時(shí)0.25% 胰酶消化傳代，本實(shí)驗(yàn)使用2～3代細(xì)胞。

1.2.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CFs胰酶消化后，用培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，以每孔300個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μL，貼壁培養(yǎng)24 h，吸去上清，加無(wú)血清培養(yǎng)基，血清饑餓24 h。分別進(jìn)行：① 不同濃度葡萄糖對(duì)CFs增殖的作用：分為正常對(duì)照組(Control，含5.5 mmol·L-1葡萄糖)和葡萄糖組(含10、20、25、30、50 mmol·L-1葡萄糖)；② 高糖誘導(dǎo) CFs增殖的時(shí)間效應(yīng)：分為 Control組，高糖組(HG組，含25 mmol·L-1葡萄糖)，作用時(shí)間分為 12 h、 24 h、48 h；③Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo) CFs增殖的作用：分為 Control組、HG組(25 mmol·L-1)、HG+ Sal B(12.5、25、50 μmol·L-1)、高滲透壓對(duì)照組 (MG組，含 5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)。按上述不同的處理因素作用48 h，每組設(shè) 6復(fù)孔。每孔加入CCK-8試劑10 μL，輕輕搖晃96 孔板后放入37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，取出96孔板置于酶標(biāo)儀上，490 nm測(cè)定各孔吸光度OD值。

1.2.3分組及藥物處理 實(shí)驗(yàn)分為：① Control組(含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，②MG組(含5.5 mmol·L-1葡萄糖+19.5 mmol·L-1甘露醇)，③ HG組 (含25 mmol·L-1葡萄糖)，④ HG + Sal B組(25 μmol·L-1Sal B預(yù)處理細(xì)胞1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑤ HG+XAV939組(1 μmol·L-1XAV939預(yù)處理細(xì)胞 1 h，加25 mmol·L-1葡萄糖)，⑥ XAV939組(1 μmol·L-1)，⑦ Sal B組(25 μmol·L-1)。

1.2.4苦味酸天狼猩紅染色 取出藥物作用后的24 孔培養(yǎng)板，棄掉培養(yǎng)基， PBS 清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS清洗3次，0.5% 的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)破膜20 min，PBS 清洗3 次，天狼猩紅染液染色1 h，蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核5 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5免疫熒光法 各組CFs加不同條件培養(yǎng)基藥物處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，冷PBS 漂洗3次；新鮮配制4% 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 漂洗3次；0.3% Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3 次；室溫山羊血清工作液封閉60 min；滴加α-SMA一抗溶液，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBS漂洗，用含DAPI的抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察及拍照。

1.2.6Western blot 各組CFs加不同條件培養(yǎng)基藥物處理24 h后，冷PBS沖洗3次，立即放入預(yù)冷的裂解液中，每隔5 min震蕩20 s，4 ℃ 12 000×g離心，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每個(gè)泳道蛋白上樣量為20 μg，行 SDS-PAGE凝膠電泳，觀察Marker移動(dòng)情況。電泳后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，分別加兔抗大鼠α-SMA一抗、兔抗大鼠 β-catenin一抗、兔抗大鼠p-GSK 3β 一抗、兔抗大鼠GSK 3β 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日早上取出膜，TBST洗膜3次，每次10 min，將膜放入山羊抗兔二抗 (1 ∶1 000)中，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，行ECL化學(xué)發(fā)光顯影。利用 Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對(duì)蛋白帶進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用One-way ANOVA和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對(duì)CFs增殖的作用CCK-8結(jié)果(Tab 1)顯示，不同濃度(5.5、10、20、25、30、50 mmol·L-1)葡萄糖誘導(dǎo)CFs 24 h，25、30、50 mmol·L-1葡萄糖誘導(dǎo)，CFs增殖率明顯增加，實(shí)驗(yàn)中25 mmol·L-1高糖誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞增殖率已經(jīng)達(dá)到196 %(P<0.01)，本實(shí)驗(yàn)確定高糖誘導(dǎo)濃度為25 mmol·L-1。

Tab 1 Effects of different concentrations of glucoseon

GroupConcentration/mmol·L-1OD490Proliferationrate/%Control5.50.276±0.016100.00HG100.278±0.020100.79200.291±0.038105.50250.541±0.277??196.07300.572±0.226??207.56500.571±0.321??207.25

**P<0.01vscontrol

2.2 高糖誘導(dǎo)CFs增殖時(shí)間效應(yīng)根據(jù)Tab 1結(jié)果，應(yīng)用25 mmol·L-1葡萄糖作用12、24及48 h，結(jié)果(Tab 2)顯示，作用24 h時(shí)CFs增殖率最高，達(dá)到204.6%(P<0.01)，本實(shí)驗(yàn)確定高糖作用時(shí)間為24 h。

Tab 2 Time effect of high glucose on proliferation

GroupTime/hOD490Proliferationrate/%Control120.267±0.026100.00HG120.294±0.022110.11Control240.304±0.019100.00HG240.623±0.019??204.60Control480.397±0.027100.00HG480.503±0.044??126.80

**P<0.01vscontrol

2.3 不同濃度Sal B對(duì)CFs增殖的影響CCK-8結(jié)果(Tab 3)顯示，與Control組相比，MG組CFs無(wú)明顯變化，提示高滲透壓對(duì)CFs增殖無(wú)明顯影響，而25 mmol·L-1高糖作用可促進(jìn)CFs增殖(P<0.01)；與HG組相比，經(jīng)不同劑量(12.5、25、50 μmol·L-1)Sal B 干預(yù)，對(duì)CFs增殖均出現(xiàn)抑制作用(P<0.05)，25 μmol·L-1差異具有極顯著性(P<0.01)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取Sal B的給藥濃度為25 μmol·L-1。

2.4 Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo)CFs膠原纖維表達(dá)的影響天狼猩紅染色(Fig 1)顯示：倒置顯微鏡下，膠原纖維為粉紅色，細(xì)胞核為紫紅色。與Control組相比，HG組細(xì)胞數(shù)量增多，紅色膠原面積明顯增加。與HG組相比，經(jīng)Sal B以及XAV939預(yù)處理后，紅色膠原面積減少，細(xì)胞間隙變大；單獨(dú)應(yīng)用Sal B及XAV939對(duì)CFs膠原纖維表達(dá)無(wú)明顯影響。表明Sal B可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑減少高糖誘導(dǎo)CFs膠原沉積。

Tab 3 Effects of different concentrations of Sal B

GroupConcentration/mmol·L-1OD490Proliferationrate/%Control0.307±0.021100.00MG0.306±0.02999.78HG0.595±0.010??193.71HG+Sal B12.50.560±0.033#182.15250.374±0.023##121.60500.363±0.009##118.18

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG

2.5 Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo)CFsα-SMA表達(dá)的影響免疫熒光(Fig 2)顯示：紅色熒光代表α-SMA，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，與Control組相比，HG組細(xì)胞紅色熒光明顯增強(qiáng)；與HG組相比，經(jīng)Sal B(25 μmol·L-1)以及XAV939預(yù)處理后，紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱；單獨(dú)Sal B組及單獨(dú)XAV939組與Control組相比熒光強(qiáng)度變化不明顯。

Western blot(Fig 3)顯示：與Control組相比，HG組α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與HG組相比，HG+XAV939組與HG+Sal B組α-SMA蛋白水平降低(P<0.01)，HG+XAV939組降低更為明顯；單獨(dú)Sal B組及單獨(dú)XAV939組與Control組相比無(wú)明顯變化。α-SMA為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，提示高糖可誘導(dǎo)CFs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，

Fig 1 Effects of Sal B on expression of collagen fiber in CFs induced by high glucose(400×)

A：Control group;B：HG group; C：HG + Sal B group; D：HG + XAV939 group; E：XAV939 group; F：Sal B group

Fig 2 Effect of Sal B on expression of α-SMA in CFs induced by high glucose(400 ×)

Sal B以及抑制Wnt/β-catenin信號(hào)可阻止高糖誘導(dǎo)CFs轉(zhuǎn)分化程度。

2.6 Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo)CFs β-catenin、 p-GSK 3β表達(dá)影響Western blot(Fig3)顯示：與Control 組相比，HG組β-catenin、p-GSK 3β蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與HG組相比，HG+XAV939組與HG+Sal B組β-catenin、p-GSK 3β蛋白水平降低(P<0.01)，HG+XAV939 組降低更為明顯；單獨(dú)Sal B組及單獨(dú)XAV939組與Control組相比無(wú)明顯變化。表明Sal B可通過(guò)下調(diào) β-catenin、 p-GSK 3β表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)CFs增殖及轉(zhuǎn)分化程度。

Fig 3 Effects of Sal B on expression of α-SMA,β-catenin

1：Control group; 2：HG group; 3：HG + Sal B group;4：HG + XAV939 group; 5：XAV939 group;6：Sal B group;**P<0.01vsControl group;##P<0.01vsHG group

3 討論

CFs是心肌間質(zhì)的主要細(xì)胞成分，糖尿病狀態(tài)下CFs增殖可合成大量膠原，ECM合成增加，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化。然而，單純CFs增殖不足以完成纖維化進(jìn)程，CFs轉(zhuǎn)分化(即CFs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞)則是心肌間質(zhì)纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵所在，轉(zhuǎn)分化作用可導(dǎo)致ECM合成級(jí)聯(lián)放大，從而加重心肌間質(zhì)纖維化及心臟重構(gòu)的病理進(jìn)程[7]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞特征性標(biāo)志物，本研究中應(yīng)用高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)誘導(dǎo)，CFs增殖率顯著升高，α-SMA表達(dá)增加，膠原纖維增多；證實(shí)高糖可誘導(dǎo)CFs增殖轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，特征性α-SMA表達(dá)增加，與Tao等[8]報(bào)道一致。實(shí)驗(yàn)中經(jīng) Sal B(25 μmol·L-1)預(yù)處理后，明顯抑制了CFs增殖及膠原纖維沉積，α-SMA表達(dá)明顯減少，提示Sal B對(duì)高糖誘導(dǎo)CFs增殖及轉(zhuǎn)分化有一定的抑制作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控組織器官發(fā)育的重要途徑，參與細(xì)胞增殖、遷移及間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程。其中β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量與狀態(tài)對(duì)該途徑起決定作用，β-catenin在胞質(zhì)中積累后進(jìn)入細(xì)胞核，是Wnt信號(hào)傳遞的重要環(huán)節(jié)，β-catenin異常激活參與纖維增生疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。劉理靜等[1]研究顯示，高糖可通過(guò)激活β-catenin引起肺成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成。也有研究顯示，持續(xù)血糖可通過(guò)激活Wnt/β-catenin/TCF7L2通路，使β-catenin活化參與糖尿病心肌病的病理生理過(guò)程[4,10]。本研究中，高糖(25 mmol·L-1葡萄糖)誘導(dǎo)，CFs內(nèi)β-catenin表達(dá)明顯增加，經(jīng)Sal B及XAV939預(yù)處理后，β-catenin表達(dá)明顯減少。提示Sal B可抑制高糖誘導(dǎo)CFs增殖轉(zhuǎn)分化，其作用與下調(diào)β-catenin表達(dá)有關(guān)。

正常情況下，β-catenin受多種蛋白調(diào)控， GSK 3β為其負(fù)向調(diào)節(jié)因素。當(dāng)無(wú) Wnt 配體時(shí)，GSK 3β的調(diào)控作用使胞質(zhì)內(nèi)β-catenin處于較低水平；當(dāng)有Wnt配體時(shí)，Wnt配體與膜上Frizzled及LRP5/6受體結(jié)合，形成復(fù)合物，激活胞內(nèi)的 Dsh，從而抑制GSK 3β活性，阻止胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的降解；當(dāng)GSK 3β的N端 9位絲氨酸被磷酸化后，p-GSK 3β增加，降低了GSK 3β活性，從而導(dǎo)致胞質(zhì)β-catenin過(guò)度表達(dá)[11]。有學(xué)者在小鼠腎間質(zhì)纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，p-GSK 3β水平與 β-catenin 表達(dá)同步增加[12]；Liu等[13]發(fā)現(xiàn)， Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在糖尿病誘導(dǎo)的心肌損傷中被激活，推測(cè)其與糖尿病誘導(dǎo)的心肌病變的發(fā)生有關(guān)。本研究中，高糖誘導(dǎo)CFs內(nèi)p-GSK 3β 與 β-catenin亦出現(xiàn)同步增加；經(jīng)Sal B及Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939預(yù)處理后，p-GSK 3β、β-catenin表達(dá)出現(xiàn)同步下調(diào)；提示GSK 3β磷酸化，可上調(diào)β-catenin表達(dá)，使α-SMA表達(dá)增多，促進(jìn)高糖誘導(dǎo)CFs增殖及轉(zhuǎn)分化；Sal B可通過(guò)下調(diào)p-GSK 3β、β-catenin表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)CFs細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化過(guò)程。

綜上所述，高糖作用CFs可上調(diào)p-GSK 3β與β-catenin表達(dá)，促進(jìn)CFs增殖、轉(zhuǎn)分化；Sal B可有效抑制高糖誘導(dǎo)CFs增殖及轉(zhuǎn)分化作用，其機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。