趙永吉,陸 瑩,游志鵬

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科,江西 南昌 330006)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是一種慢性疾病，是人類致盲的主要原因之一，到2010年全球有1.66億人患有糖尿病視網(wǎng)膜病，并且到2030年這一數(shù)字會增加到1.9億，每年的新增患者達200萬[1]。糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機制之一是線粒體電子傳遞鏈活性氧ROS的增加，它導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織損傷加重，使視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞不可逆凋亡[2]。毛細血管內(nèi)皮細胞及周細胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡、炎癥反應(yīng)以及毛細血管血流動力學(xué)的改變都會引起視網(wǎng)膜缺血缺氧，而缺血缺氧是導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管的重要原因，它會促進毛細血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，并使血管內(nèi)皮細胞間的連接變得疏松[3]。大量研究顯示，蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)通路的激活是導(dǎo)致糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)病的重要原因之一，在缺氧環(huán)境中PKC-β的高表達會導(dǎo)致新生血管的形成，同時抑制PKC-β會導(dǎo)致新生毛細血管的減少[4]。

藏紅花酸是藏紅花提取物的主要成分，屬于類胡蘿卜素衍生物，口服藏紅花酸可經(jīng)小腸快速吸收，并以游離或與葡萄糖醛酸結(jié)合的方式存在于血漿中[5]。目前藏紅花酸可治療視網(wǎng)膜缺血/再灌注[6]以及氧化應(yīng)激而導(dǎo)致的視網(wǎng)膜凋亡[7]并且研究發(fā)現(xiàn)其可以抑制視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[8]。本文探討藏紅花酸對糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護作用的機制，對于糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物治療提供新的治療靶點，為進一步的基礎(chǔ)及臨床研究提供可能基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 ♂ SD大鼠購自南昌大學(xué)動物實驗科學(xué)部，選用健康♂ SD大鼠體質(zhì)量約180 g，所有大鼠實驗前均經(jīng)檢查眼底，無眼部病變。

1.1.2試劑 藏紅花酸購自四川維克奇生物科技有限公司(批號：wkq16041207)；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自美國Sigma公司；兔抗鼠cleaved-caspase-3購自武漢塞維爾生物公司；兔抗鼠一抗PKC-β抗體、羊抗兔二抗IgG抗體、兔抗鼠一抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司；TRIzol試劑盒購自全式金生物科技公司、RNA保存液購自武漢博士德生物有限公司、Premix×TaqTM試劑盒、RNase-free water、SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)購自日本TaKaRa公司；其余試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.3儀器 倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；蛋白凝膠電泳系統(tǒng)美國(Bio-Rad公司)；ABI7300實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；RM2016 型病理石蠟切片機(德國徠卡公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；眼科顯微手術(shù)器械(南京康華醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 造模及分組

1.2.1造模 采用STZ建立糖尿病大鼠模型，STZ按4 g·L-1溶解于0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液(pH 4.0～4.5)，注射量為60 mg·kg-1，72 h后取大鼠尾靜脈血，測血糖，當(dāng)血糖≥16.6 mmol·L-1即為成模大鼠，正常組大鼠將造模藥物換成等量生理鹽水。

1.2.2實驗分組 分4組每組10只大鼠，正常對照組(CON)：食道灌胃給0.5% CMC-Na 3 mL；糖尿病對照組(DM)：食道灌胃給0.5% CMC-Na 3 mL， DM+藏紅花酸低劑量組[DM+CRO(L)]：經(jīng)食道灌胃給藏紅花酸50 mg·kg-1，qd.8周， DM+藏紅花酸高劑量組[DM+CRO(H)]：經(jīng)食道灌胃給藏紅花酸100 mg·kg-1，qd.8周。

1.3 免疫組化石蠟切片脫蠟入水，微波抗原修復(fù)10 min，過氧化氫封閉10 min，加3% BSA，室溫封閉30 min，滴加cleaved-caspase-3抗體，置于濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育24 h， 加二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min，玻片置于脫色搖床上洗滌15 min后加DBA顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，顯色棕黃色為陽性，脫水封片，圖像采集：采用HPIAS-1000高清晰病理彩色圖像分析系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)染色陽性產(chǎn)物進行分析。記錄6個400倍視野陽性單位(PU)，取其平均值，用PU值的大小代表陽性產(chǎn)物表達量的多少。

1.4qRT-PCR引物設(shè)計,Bcl-2上游引物5′-AGATCGTGATGAAGTACA-3′，下游引物 5′-TGCTCTCAGGCTGGAAGGA-3′；BAX上游引物 5′-CACCAGCTCTGAACAGATCAT-3′，下游引物5′-CCTCTGCAGCTCCATGTTGT-3′； PKCβ上游引物5′-GAGGTCCTCATCGTTGTTGT-3′，下游引物5′-TGATAGTCTTGGTCTTCTGC-3′；GAPDH上游引物5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA3-′下游引物5′-GACTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。用TRIzol提取RNA并檢測純度，逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明進行操作，實時熒光定量PCR按SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒操作進行，反應(yīng)條件：預(yù)變性；60 ℃，30 s；95 ℃，30 s，95 ℃，3 s； PCR擴增40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR的擴增曲線和溶解曲線輸出CT值，按2ΔΔCT數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.5 蛋白質(zhì)印跡提取眼球視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮中總蛋白，將配置好SDS-PAGE膠置于電泳槽中，待用蛋白置于水鍋中煮沸5 min后，充分混勻，上樣孔中分別加入Marker及樣品蛋白20 μL，樣品經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜兩分鐘，加入一抗,置于4 ℃冰箱中孵育過夜，用1×TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入稀釋的二抗(1% BSA以1 ∶10 000稀釋)，置于水平搖床中，孵育60 min后1×TBST溶液洗膜10 min×3次，后在暗室中進行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果判定免疫組化結(jié)果如Tab 1、Fig 1所示，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中凋亡細胞主要存在于神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層，藏紅花酸高劑量和低劑量組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細胞層caspase-3的表達較糖尿病對照組下降，藏紅花酸高劑量處理組較藏紅花酸低劑量處理組caspase-3表達下降。

2.2 qRT-PCR檢測mRNA表達

Tab 1 Average optical density of caspase-3 in each group

#P<0.05vsCON,*P<0.05vsDM,△P<0.01vsDM+CRO(L)

Fig 1 Expression of caspase-3 in the innernuclear layer and ganglion cell layer of rats

A=CON,B=DM+CRO(H),C=DM+CRO(L),D=DM(400×)

2.2.1TNF-α mRNA表達 qRT-PCR檢測顯示TNF-α mRNA紅花酸高劑量及低劑量處理組間表達對比無明顯差異，其余各組之間的表達如Tab 2示，與對照組相比差異均有顯著性。

Tab 2 Expression of TNF-α mRNAin rat retinal nerve

#P<0.05vsCON,*P<0.01vsDM

2.2.2Bax mRNA表達 如Tab 3示藏紅花酸高劑量及低劑量處理組大鼠Bax mRNA的表達較糖尿病對照組大鼠下降，藏紅花酸高劑量較低劑量處理組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 3 Expression of Bax mRNAin rat retinal nerve

#P<0.01vsCON,*P<0.01vsDM,△P<0.05vsDM+CRO(L)

2.2.3Bcl-2 mRNA表達 如Tab 4示藏紅花酸高劑量及低劑量處理組大鼠Bcl-2 mRNA的表達較糖尿病對照組大鼠升高，藏紅花酸高劑量較低劑量處理組表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 4 Expression of Bcl-2 mRNAin rat retinal nerve

#P<0.05vsCON,*P<0.01vsDM,△P<0.05vsDM+CRO(L)

2.2.4PKC-β mRNA的表達 如Tab 5示藏紅花酸高劑量及低劑量處理組大鼠PKC-β mRNA的表達較糖尿病對照組大鼠均下降，藏紅花酸高劑量較低劑量處理組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab 5 Expression of PKC-beta mRNAin rat retinal nerve

#P<0.01vsCON,*P<0.01vsDM,△P<0.05vsDM+CRO(L)

2.3 蛋白質(zhì)印記的檢測各組PKC蛋白與內(nèi)參GAPDH 蛋白質(zhì)印記結(jié)果如Fig 2所示，藏紅花酸高劑量及低劑量處理組大鼠PKC的表達較糖尿病對照組大鼠下降(t=4.95,P=0.00)，藏紅花酸高劑量較低劑量處理組表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.68，P=0.00)。

Fig 2 Expression of PKC in rat retinal nerve epithelium

A=DM+CRO(L),B=DM+CRO(H),C=DM,D=CON.#P<0.01vsCON,*P<0.01vsDM,△P<0.05vsDM+CRO(L)

3 討論

PKC廣泛分布于多種組織、器官和細胞，是多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，它控制著糖代謝并參與基因的表達調(diào)控，同時PKC的激活是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的重要原因之一[9]，本實驗通過蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮PKC的表達，發(fā)現(xiàn)藏紅花酸處理組PKC的表達較糖尿病對照組減少，表明藏紅花酸在糖尿病大鼠中可通過抑制PKC基因和蛋白表達進而對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮起到保護作用。

既往有研究發(fā)現(xiàn)，藏紅花酸可以抑制視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷，減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層及內(nèi)核層細胞的凋亡[10]，并且研究還發(fā)現(xiàn)藏紅花酸可以抑制caspase-3和caspase-9而保護由H2O2引起的視網(wǎng)膜變性[11]，而高糖使視網(wǎng)膜細胞線粒體產(chǎn)生過度氧自由基而導(dǎo)致的糖尿病視網(wǎng)膜產(chǎn)生氧化應(yīng)激損害[12]，本實驗通過免疫組化檢測caspase-3在視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮表達發(fā)現(xiàn)caspase-3主要表達在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層，并且藏紅花酸處理組較糖尿病對照組表達降低，藏紅花酸高劑量組較藏紅花酸低劑量組表達下降，這表明藏紅花酸減少糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮細胞的凋亡。研究顯示高血糖同時可以激活視網(wǎng)膜內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，使視網(wǎng)膜內(nèi)免疫炎癥失調(diào)，位于視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層的小膠質(zhì)細胞是主要的免疫炎癥反應(yīng)細胞，小膠質(zhì)細胞激活而產(chǎn)生的各種神經(jīng)毒性分子如NF-κB和IL-1β[13]，并且caspase-3與炎癥因子密切相關(guān)，在糖尿病大鼠中細胞外的凋亡系統(tǒng)通常是由TNF-α受體激活，在視網(wǎng)膜血管凋亡時有大量的TNF-α受體激活，該受體的激活導(dǎo)致Bax進入線粒體，導(dǎo)致線粒體的氧自由基增加進一步觸發(fā)細胞色素C釋放進入細胞質(zhì)中，進而caspase-3誘導(dǎo)細胞的凋亡[14]。研究顯示Bcl-2可以減少糖尿病大鼠微血管中血管內(nèi)皮細胞的損害[15]，減少超氧化物的生成，并減少視網(wǎng)膜微血管白細胞的粘附，這些都有利于改善缺血缺氧的損害。本研究顯示，藏紅花酸處理組大鼠TNF-α及Bax較糖尿病對照組下降，而Bcl-2較糖尿病對照組上升，這表明藏紅花酸通過降低TNF-α的表達，減少TNF-α受體的激活減少視網(wǎng)膜內(nèi)炎癥反應(yīng)，同時減少Bax基因表達，進而減少凋亡蛋白caspase-3的表達，同時抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2的增加也減少caspase-3表達，從而減少神經(jīng)節(jié)細胞及內(nèi)核層細胞的凋亡。

綜上所述，藏紅花酸通過抑制TNF-α、caspase-3的表達，減少凋亡促進基因Bax表達，并提高凋亡抑制基因Bcl-2的表達，進而抑制視網(wǎng)膜中內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，并且藏紅花酸通過抑制PKC基因和蛋白的表達，減少糖尿病視網(wǎng)膜病變通路之一的PKC通路的激活，從而對糖尿病性視網(wǎng)膜病變起到治療作用。

(致謝：本實驗分別于江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室和南昌大學(xué)動物實驗科學(xué)部完成，感謝江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室老師對本實驗的指導(dǎo)。)