鐘雅男，陳春霞，趙 峰，郝志翔，徐吟雪，印曉星，周雪妍

(徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三大惡性腫瘤，其全球發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率高且治愈率低[1]。預(yù)計(jì)至2030年，CRC的全球負(fù)擔(dān)將增加60%[2]。CRC發(fā)病隱匿，早期癥狀多不明顯，缺乏早期診斷的有效標(biāo)準(zhǔn)，因此需對(duì)CRC病因?qū)W深入研究并探討影響其發(fā)生、發(fā)展的高危因素。

膽汁酸(bile acids，BAs)是膽汁的主要成分，由肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化而來。各類型膽汁酸可分為三類：?jiǎn)误w膽汁酸：膽酸(cholic acid，CA)，石膽酸(lithocholic acid，LCA)，脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)，熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)，鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)，豬脫氧膽酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)，α-鼠膽酸(α-muricholic acid，α-MCA)，β-鼠膽酸(β-muricholic acid，β-MCA)；膽汁酸的甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物：甘膽酸(glycocholicacid，G-CA)，甘氨石膽酸(glycinocholic acid，G-LCA)，甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid，G-DCA)，甘氨鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid，G-CDCA)，甘氨熊脫氧膽酸(glycoursodeoxycholic acid，G-UDCA)；膽汁酸的牛磺酸結(jié)合產(chǎn)物：?；悄懰?taurocholic acid，T-CA)，?；敲撗跄懰?taurodeoxycholic acid，T-DCA)，?；切苊撗跄懰?tauroursodeoxycholic acid，T-UDCA)，?；鞘懰?taurocholic acid，T-LCA)，?；蛆Z脫氧膽酸(tauro-chenodeoxycholic acid，T-CDCA)，牛磺豬脫氧膽酸(tauro-hyodeoxycholic acid，T-HDCA)，牛磺β-鼠膽酸(tauro-β-muricholic acid，T-β-MCA)。各類型膽汁酸總和為總膽酸(total bile acid，TBA)。腸炎狀態(tài)下BAs選擇性的在結(jié)腸組織中蓄積[3]。其中以疏水性膽汁酸包括CDCA、LCA和DCA最為明顯。LCA刺激結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖導(dǎo)致CRC的發(fā)生發(fā)展[4]。而DCA進(jìn)一步破壞腸道黏膜屏障促進(jìn)腸道腫瘤的發(fā)生[5]。因此，疏水性膽汁酸在結(jié)腸組織中的蓄積是CRC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)是影響B(tài)As生成的限速酶。法呢醇受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)廣泛分布于與BAs代謝密切相關(guān)的器官[6]。FXR參與BAs的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，調(diào)控體內(nèi)BAs的合成，從而維持BAs的穩(wěn)態(tài)[7]。因此，F(xiàn)XR和CYP7A1的異常表達(dá)介導(dǎo)的BAs穩(wěn)態(tài)變化進(jìn)一步促進(jìn)CRC的發(fā)生發(fā)展。

維生素D(vitamin D，VD)是多功能的類固醇激素，活化的VD通過結(jié)合激活VD受體在體內(nèi)起到調(diào)節(jié)鈣磷和脂質(zhì)代謝、發(fā)揮抗癌活性等多種生理作用[8]。VD的活性代謝產(chǎn)物25羥維生素D3(25-hydroxyvitamin D3，25(OH)D3)濃度與CRC之間存在強(qiáng)烈的反向相關(guān)性。25(OH)D3水平的最低四分位數(shù)比最高四分位數(shù)的癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。具有較高25(OH)D3水平的患者癌癥特異性和總死亡率明顯降低[9]。因此，VD的缺乏是CRC的危險(xiǎn)因素，VD的補(bǔ)充可以抑制CRC的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)的機(jī)制仍不明確。

VD在BAs代謝中發(fā)揮重要作用，可通過抑制限速酶CYP7A1的表達(dá)來抑制BAs合成[10]，而BAs的穩(wěn)態(tài)與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。由此，我們推測(cè)，VD是否可能作用于BAs穩(wěn)態(tài)進(jìn)而調(diào)控CRC的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為C57BL/6 ♂小鼠，利用腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)并給予硫酸葡聚糖鈉鹽(Dextran Sulfate Sodium Salt, DSS)誘導(dǎo)建立小鼠CRC模型，通過飼料喂養(yǎng)VD進(jìn)行治療，考察VD對(duì)BAs內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控與CRC發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系，為CRC臨床藥物治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量15 g(4～5周齡)，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)新藥與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，環(huán)境溫度(25±2)℃，濕度(55±5)%。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠均可自由飲水。

1.2 試劑氧化偶氮甲烷(貨號(hào)A5486)、去氫膽酸(貨號(hào)30830)購自Sigma公司；HE染色試劑盒(貨號(hào)C0105)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；硫酸葡聚糖鈉鹽(貨號(hào)0216011010)，購自美國MP公司；TRNAiso Plus(貨號(hào)9108)、PrimeScript RT reagent Kit(貨號(hào)RR037A)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)RR820A)，購自寶生物工程(大連)有限公司；AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)純化飼料(貨號(hào)D10012G)，購自福貝世亨生物醫(yī)藥(上海)有限公司。

1.3 儀器Agilent 6420A三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、MassHunter Qualitative定性分析軟件、MassHunter Quantitative定量分析軟件和MassHunter Acquisition數(shù)據(jù)采集軟件(美國Agilent公司)；NanoDrop 1 000核酸濃度測(cè)定儀(美國Thermo Scientific公司)；Light Cycle 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Tecnai G2透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.4 CRC小鼠模型的建立♂C57BL/6小鼠，適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只：正常對(duì)照組(Control組)、結(jié)直腸癌組(CRC組)、結(jié)直腸癌+VD補(bǔ)充組(CRC+VD組)。其中，CRC組和CRC+VD組于第1天腹膜內(nèi)注射AOM(10 mg·kg-1)。第8天起，給予小鼠2.5% DSS水溶液1周作為飲用水，第15天起使小鼠正常飲水2周。第29天起重復(fù)第8天到第28天的循環(huán)兩次，第70天，造模結(jié)束。CRC+VD組在AOM+DSS誘導(dǎo)的CRC模型基礎(chǔ)上，給予含VD33 000 IU·kg-1的AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)純化飼料自由飲食。通過眼眶采血收集血液，頸脫位法處死各組小鼠并收集肝臟組織，同時(shí)完整地取出結(jié)直腸，使用直尺測(cè)量結(jié)直腸長(zhǎng)度，隨后收集結(jié)腸組織，樣本均保存于-80 ℃冰箱中。

1.5 HE染色取結(jié)腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，按步驟經(jīng)包埋，切片，再依次脫蠟，染色，脫水，封片，最后晾干。顯微鏡觀察結(jié)腸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

1.6 qPCR檢測(cè)TRIzol提取肝臟組織總RNA，并根據(jù)PrimeScript RT說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用Roche LightCycle 480軟件計(jì)算樣本中各目的基因的Ct值進(jìn)行定量PCR分析。以GADPH的mRNA水平作為參比對(duì)照，采用ΔΔCt法得到各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，反應(yīng)引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。序列見Tab 1。

Tab 1 Primers and amplification length of qPCR reaction

1.7 膽汁酸及其代謝產(chǎn)物的含量測(cè)定

1.7.1小鼠血清的膽汁酸提取 精密量取50 mL血清，加入150 μL冰乙腈溶液(I.S.100 ng·mL-1)混勻。4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，吸取大于170 μL上清液。40 ℃旋轉(zhuǎn)干燥后，濃縮物復(fù)溶于100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸)，并在4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min。取上清置于進(jìn)樣瓶中，最終以20 μL進(jìn)樣。采用已建立并完成驗(yàn)證的20種膽汁酸活性物質(zhì)組分(CDCA、CA、DCA、LCA、G-CA、G-CDCA、T-CDCA、T-DCA、UDCA、HDCA、G-LCA、G-UDCA、G-DCA、T-UDCA、T-HDCA、T-LCA、α-MCA、β-MCA、T-CA和T-β-MCA)的LC-MS/MS定量分析方法[3]。

1.7.2小鼠結(jié)腸的膽汁酸提取 精密稱取300 mg結(jié)腸組織，用1.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇勻漿后，55 ℃超聲提取30 min。4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，取上清。吸取100 μL提取物，加入500 μL冰乙腈溶液混勻。其余步驟同小鼠血清膽汁酸測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 VD對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用與Control組相比，CRC組小鼠體質(zhì)量于5～13周體質(zhì)量低于Control組(P<0.01)；而CRC+VD組體質(zhì)量與CRC組相比相對(duì)較高，但至造模結(jié)束，三組小鼠體質(zhì)量并無明顯差異，見Fig 1A。結(jié)直腸長(zhǎng)度結(jié)果顯示，CRC組小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度明顯較Control組短(P<0.01)；而與CRC組相比，CRC+VD組結(jié)直腸長(zhǎng)度已變長(zhǎng)(P<0.01)，見Fig 1B。Fig 1C染色結(jié)果顯示，Control組結(jié)腸組織基底膜完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)良好；CRC組結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，癌組織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，細(xì)胞排列紊亂，失去正常的結(jié)構(gòu)和層次；CRC+VD組結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，細(xì)胞僅呈現(xiàn)輕度水腫狀態(tài)，炎癥情況有所緩解。

2.2 VD對(duì)膽汁酸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用Fig 2結(jié)果顯示，血清中20種BAs活性物質(zhì)的含量分布情況。與Control組比較，CRC組小鼠血清樣本的總膽汁酸水平降低(P<0.01)，見Fig 2D；同時(shí)Fig 2A，F(xiàn)ig 2B顯示，CRC組G-UDCA，DCA，HDCA，T-HDCA，UDCA，T-LCA，T-CA，LCA，T-CDCA，CDCA和T-DCA的含量顯著降低(P<0.05)，而α-MCA、β-MCA的含量明顯增加(P<0.05)，表明CRC造模小鼠體內(nèi)BAs穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)紊亂。與CRC組相比，CRC+VD組小鼠血清樣本中T-LCA，LCA，T-CA，T-DCA，T-HDCA水平升高(P<0.05)，α-MCA、β-MCA的含量顯著降低(P<0.05)，見Fig 2B，F(xiàn)ig 2C，提示給予CRC造模小鼠VD后，小鼠血清BAs水平逐漸好轉(zhuǎn)。

檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中BAs活性物質(zhì)的含量，與Control組比較，CRC組小鼠結(jié)腸組織樣本的總膽汁酸水平升高，見Fig 3D，其中，T-β-MCA、G-DCA、G-LCA、DCA和α-MCA的含量顯著升高(P<0.05)，而T-HDCA、HDCA的含量明顯降低(P<0.05)，見Fig 3A，F(xiàn)ig 3B，同時(shí)在小鼠血清樣本中大部分BAs含量降低，而結(jié)腸部位卻出現(xiàn)BAs的蓄積，提示在腸炎腸癌狀態(tài)下，BAs穩(wěn)態(tài)失衡且蓄積在結(jié)腸部位。而與CRC組相比，CRC+VD組小鼠結(jié)腸組織中總膽汁酸水平明顯降低(P<0.05)，見Fig 3D，其中G-DCA、CDCA、G-LCA、LCA、α-MCA、T-DCA、DCA、UDCA和HDCA含量均降低(P<0.05)，見Fig 3B，F(xiàn)ig 3C，結(jié)果表明給予CRC造模組小鼠VD后，小鼠結(jié)腸部位BAs濃度逐漸恢復(fù)并趨近于正常水平。

Fig 1 Inhibition of vitamin D on colorectal cancer model

A:Body weight curves of mice; B:The colorectal length of mice; C:The appearance and structure of colon tissue by HE staining.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

Fig 2 Effects of vitamin D on bile acids in mouse

A:The concentrations of BAs in serum of control group; B:The concentrations of BAs in serum of CRC group; C:The concentrations of BAs in serum of CRC+VD group. D:The concentrations of total BAs in serum. (1:T-β-MCA;2:G-CA;3:CA;4:G-DCA;5:T-CDCA;6:CDCA;7:G-LCA;8:T-LCA;9:LCA;10:α-MCA;11:G-UDCA;12:T-CA;13:T-DCA;14:DCA;15:β-MCA;16:T-UDCA;17:UDCA;18:G-CDCA;19:T-HDCA;20:HDCA).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCRC group.

通過繪制的BAs含量圖譜發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸部分蓄積的BAs生理活性與毒性均取決于其分子結(jié)構(gòu)的極性。因此，實(shí)驗(yàn)中將疏水性膽汁酸濃度除以膽汁酸總濃度，以此比值作為膽汁酸疏水性大小的指標(biāo)，F(xiàn)ig 4結(jié)果所示，在血清與結(jié)腸組織樣本中膽汁酸的疏水性整體趨勢(shì)與總體膽汁酸水平的趨勢(shì)保持一致。與Control組相比，CRC組小鼠結(jié)腸組織中疏水性膽汁酸比例增大(P<0.05)；而VD的補(bǔ)充明顯降低了疏水性膽汁酸的比例(P<0.01)。提示VD的補(bǔ)充能夠減少疏水性膽汁酸在結(jié)腸部位的比例失衡及蓄積。

肝臟qPCR方法檢測(cè)FXR、CYP7A1的mRNA表達(dá)水平(Fig 5)，CRC組中FXR、CYP7A1的mRNA表達(dá)與Control組相比明顯升高(P<0.01)，與CRC組小鼠體內(nèi)BAs水平升高趨勢(shì)一致。當(dāng)給予VD治療后，F(xiàn)XR和CYP7A1表達(dá)降低，其中CYP7A1表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，結(jié)果證明了VD可以改善CRC小鼠體內(nèi)BAs失衡的狀態(tài)。

3 討論

CRC是世界四大癌癥死亡原因之一，據(jù)預(yù)測(cè)到2030年，可達(dá)220萬個(gè)新發(fā)病例和110萬例死亡人數(shù)[2]。CRC被認(rèn)為是由環(huán)境、飲食、慢性炎癥、胃腸道代謝紊亂等因素綜合作用所導(dǎo)致的癌癥，因其發(fā)病隱匿，病因復(fù)雜，目前仍沒有有效的治療藥物。因此，對(duì)CRC病因?qū)W進(jìn)行深入研究，探討影響其發(fā)生發(fā)展的高危因素，對(duì)CRC臨床干預(yù)策略的優(yōu)化以及疾病診斷治療的管控均具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS/MS定量分析方法，測(cè)定CRC小鼠血清和結(jié)腸組織中BAs的含量變化情況，考察VD對(duì)BAs的調(diào)控作用，為臨床診斷治療提供參考價(jià)值。

Fig 3 Effects of vitamin D on bile acids in mouse

A:The concentrations of BAs in colon of control group; B:The concentrations of BAs in colon of CRC group; C:The concentrations of BAs in colon of CRC+VD group; D. The concentrations of total BAs in colon. (1:T-β-MCA;2:G-CA;3:CA;4:G-DCA;5:T-CDCA;6:CDCA;7:G-LCA;8:T-LCA;9:LCA;10:α-MCA;11:G-UDCA;12:T-CA;13:T-DCA;14:DCA;15:β-MCA;16:T-UDCA;17:UDCA;18:G-CDCA;19:T-HDCA;20:HDCA).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCRC group.

Fig 4 Proportion of hydrophobic bile acids in

A:The concentrations of hydrophobic bile acids in serum; B:The concentrations of hydrophobic bile acids in colon;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

研究表明，VD與CRC的高發(fā)密切相關(guān)，缺乏VD、高脂肪或低纖維素等飲食因素在CRC的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，增加了CRC的發(fā)病率，Meta分析顯示，與具有低25(OH)D3水平的患者相比，具有高25(OH)D3水平的患者的結(jié)腸直腸癌風(fēng)險(xiǎn)降低30%～40%[11]。動(dòng)物模型研究明確地表明VD的攝入能夠延緩化學(xué)誘導(dǎo)的低等級(jí)腫瘤前病變的形成，甚至阻止結(jié)腸高度發(fā)育不良的發(fā)展[12]。

Fig 5 Relative level of mRNA expression

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCRC group.

在本實(shí)驗(yàn)中，除Control組外，利用AOM+DSS誘導(dǎo)的CRC模型，并分為CRC組和CRC+VD組。造模結(jié)束后對(duì)小鼠體重、結(jié)直腸長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)計(jì)算，并觀察小鼠結(jié)腸組織HE染色情況。CRC組的小鼠造模過程中體重下降，結(jié)直腸長(zhǎng)度減少，HE染色提示結(jié)腸無腺體結(jié)構(gòu)，包膜缺失且細(xì)胞增殖情況紊亂，而CRC+VD組則表現(xiàn)出一定的逆轉(zhuǎn)腸炎腸癌進(jìn)展的表現(xiàn)，即結(jié)直腸長(zhǎng)度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，鏡下觀察結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)趨向正常。因此，可以初步得出結(jié)論，VD缺乏與CRC的高發(fā)密切相關(guān)，VD補(bǔ)充能夠抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展。

BAs的穩(wěn)態(tài)失衡是CRC發(fā)生發(fā)展重要誘導(dǎo)因素。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)在腸炎狀態(tài)下BAs選擇性的在結(jié)腸組織中蓄積是炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥的重要環(huán)節(jié)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRC小鼠的BAs內(nèi)穩(wěn)態(tài)顯著失衡，且在結(jié)腸處存在明顯的BAs蓄積，因此在腸炎腸癌狀態(tài)下BAs在結(jié)腸組織中蓄積是CRC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。VD已被證明在BAs代謝和CRC發(fā)展中都發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)明確報(bào)道了活性VD治療可以刺激BAs代謝[13]。關(guān)于膳食VD的研究結(jié)果也進(jìn)一步證明VD通過抑制限速酶CYP7A1的表達(dá)來抑制BAs合成[10]。FXR是一種核激素受體，可作為細(xì)胞內(nèi)BAs水平的主要傳感器。從疏水性到親水性膽汁酸的等級(jí)順序?qū)?yīng)于它們對(duì)FXR的親和力如下：LCA> DCA> CDCA> CA> UDCA> MCA[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，CRC組小鼠肝臟qPCR結(jié)果提示CRC小鼠FXR和CYP7A1的mRNA表達(dá)水平明顯升高，而當(dāng)給予小鼠VD補(bǔ)充后，小鼠BAs水平明顯改善，肝臟mRNA水平逐漸趨于正常。因此，VD的補(bǔ)充可以減少BAs在結(jié)直腸的蓄積，從而抑制CRC的發(fā)生發(fā)展。

疏水性膽汁酸具有細(xì)胞毒性，長(zhǎng)期的超生理濃度的疏水性膽汁酸暴露可以通過DNA氧化損傷、激活NF-κB、增加細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)凋亡抵抗而促進(jìn)癌癥發(fā)生[15]。因此，長(zhǎng)期暴露在較高的疏水性膽汁酸水平環(huán)境中是細(xì)胞癌變和CRC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠結(jié)腸部位膽汁酸的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)CRC組CDCA、LCA和DCA這些疏水性膽汁酸的含量顯著升高，而VD的補(bǔ)充能夠降低結(jié)腸組織中CDCA、DCA以及LCA的水平。結(jié)果表明，VD的補(bǔ)充能夠減少CRC狀態(tài)下疏水性膽汁酸的比例，降低疏水性膽汁酸對(duì)結(jié)直腸的毒性，進(jìn)一步抑制CRC的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，CRC狀態(tài)下小鼠體內(nèi)BAs穩(wěn)態(tài)失衡，而VD可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)疏水性膽汁酸的比例從而改善膽汁酸水平，調(diào)控了CRC的發(fā)生發(fā)展。