張藝，陳丹

1天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院,天津301800;2 天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

黃芪為豆科屬植物,多年生草本，分布于俄羅斯和我國內(nèi)蒙古、山西、黑龍江等地區(qū)。黃芪味甘，性微溫，歸肺經(jīng)、脾經(jīng),具有益氣、固表、促進(jìn)組織再生、生津、消腫、祛瘀、養(yǎng)血、止汗及抗腫瘤等功效[1, 2]，主要化學(xué)成分包括黃芪甲苷、環(huán)黃芪素、多糖類、氨基酸類和黃酮類等。近年研究[3, 4]顯示，黃芪除具有抗菌、托毒、止汗等功效[2, 5]外，還具有一定的抗腫瘤作用。其抗腫瘤機(jī)制主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、直接對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)體蛋白和氨基酸代謝等[6]。然而，關(guān)于黃芪抗腫瘤的具體分子機(jī)制并不清楚。2019年1～4月，本研究采用生物信息學(xué)分析方法篩選了黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因，分析了黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因生物學(xué)功能, 并探討了黃芪抗腫瘤關(guān)鍵基因表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 中醫(yī)大百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html)；STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[7]；David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)。

1.2 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因篩選 在 ETCM中檢索抗腫瘤相關(guān)靶基因，檢索詞為：黃芪，腫瘤。檢索限制條件為：中草藥。對檢索出的相關(guān)靶基因名稱在DAVID數(shù)據(jù)庫中、基因功能注釋，選取與腫瘤相關(guān)的基因，對于注釋中與腫瘤無關(guān)的基因予以剔除。

1.3 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因生物學(xué)功能及信號通路分析 采用David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論(GO)分析黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因生物學(xué)功能，采用京都基因百科全書(KEGG)分析黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因信號通路。GO功能富集包括基因表達(dá)產(chǎn)物的定位，基因表達(dá)產(chǎn)物或分子的生物學(xué)過程以及富集基因表達(dá)產(chǎn)物分子功能。KEGG信號通路主要包括富集的基因相關(guān)代謝及功能的信號通路。

1.4 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因相互作用分析及關(guān)鍵基因篩選 采用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[7]對黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，物種選擇人，作用蛋白不少于20個，相互作用關(guān)系置信度大于0.4。采用Cytocscape在篩選出的黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因中選出關(guān)鍵基因，篩選條件為按照黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因基因編碼蛋白在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與其他基因編碼蛋白的相互作用強(qiáng)弱進(jìn)行排序，選取前3個蛋白編碼基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

1.5 黃芪抗腫瘤關(guān)鍵基因表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后的相關(guān)分析 在Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)中進(jìn)行預(yù)后分析。Kaplan-Meier數(shù)據(jù)收錄了包括肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等在內(nèi)的多種腫瘤基因表水平與預(yù)后關(guān)系的數(shù)據(jù)。根據(jù)黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因mRNA在腫瘤中的表達(dá)水平，將相關(guān)腫瘤患者分為高、低表達(dá)組，Cox回歸模型Log-rank檢驗(yàn)比較高低表達(dá)組腫瘤患總生存期，并計(jì)算風(fēng)險比(HR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因、生物學(xué)功能及信號通路 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因?yàn)門VAII、TOP2A、SHMT1、POLR2A、POLR2D、SHMT2、GLYA、PLA2G1B、SLC8A1、POLR2G、CROT、LSS、INS、PTR2、ARG1、GCVT、MTHFR、SHBG、PPGMK、TK、CYP1A1。黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因生物學(xué)過程：主要富集于谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)等；黃芪相關(guān)基因細(xì)胞成分：主要富集于氧谷氨酸脫氫酶復(fù)合物、過氧化物酶體和線粒體膜等；分子功能主要富集于氧化還原酶活性、羧基裂解酶活性和糖代謝等；KEGG信號通路主要富集于維甲酸信號通路、TP53調(diào)節(jié)代謝基因信號通路及葉酸代謝信號通路等。

2.2 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因 STRING構(gòu)建黃芪抗腫瘤基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共21個相互作用蛋白，73個蛋白間相互作用關(guān)系，區(qū)域蛋白聚類指數(shù)為0.73，蛋白相互作用關(guān)系顯著(P<0.05)，見圖1A。網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因包括POLR2A、POLR2D及POLR2G，見圖1B。

注：A：黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；B：黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因。

圖1 黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因

2.3 黃芪抗腫瘤關(guān)鍵基因表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌乳、腺癌預(yù)后的關(guān)系 黃芪抗腫瘤關(guān)鍵基因POLR2A、POLR2D及POLR2G與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌預(yù)后關(guān)系見表1。POLR2D基因表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌(HR=1.20,P=0.04)及乳腺癌(HR=1.40,P=0.04)存在相關(guān)性，見表1。

表1 黃芪抗腫瘤信號通路中關(guān)鍵基因與常見腫瘤預(yù)后關(guān)系

3 討論

據(jù)《本草綱目》記載“黃耆色黃，補(bǔ)藥之長”。中醫(yī)理論認(rèn)為，黃芪具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗等臨床功效，廣泛用于表虛自汗、氣虛內(nèi)傷、精神萎靡、四肢無力、脾虛泄瀉、體虛多汗、氣虛脫肛、子官脫垂、浮腫及癰疽等病癥，用于治療心功能不全、腦卒中及感染性疾病等[8, 9]。近年有研究[10, 11]報道，黃芪具有增效減毒的臨床功效而被用于惡性腫瘤的相關(guān)輔助治療和術(shù)后康復(fù)。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分，藥理研究[12]已證實(shí)黃芪甲苷具有抗腫瘤活性。

本研究中我們在 ETCM中檢索出黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因主要為TVAII、TOP2A、SHMT1、POLR2A、POLR2D、SHMT2、GLYA、PLA2G1B、SLC8A1、POLR2G、CROT、LSS、INS、PTR2、ARG1、GCVT、MTHFR、SHBG、PPGMK、TK、CYP1A1等。POLR2A、POLR2D、POLR2G、LA2G1B為同一家族成員，生物學(xué)功能上具相似性。已有研究發(fā)現(xiàn),POLR2A、POLR2D、POLR2G、LA2G1B與包括結(jié)直腸癌[13]、前列腺癌[14]等在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及惡性程度有關(guān)，提示和述基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。同時，我們通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)黃芪抗腫瘤作用可能與抑制上述基因表達(dá)有關(guān)，提示黃芪可能通過上述基因發(fā)揮抗腫瘤作用。

有文獻(xiàn)[4]報道，黃芪中的有效成分黃芪甲苷、多糖類、黃酮類等均可激活人體細(xì)胞核體液免疫系統(tǒng)，活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞，同時促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞吞噬作用，從而達(dá)到抗腫瘤效果。本研究結(jié)果顯示，黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因生物學(xué)過程主要富集于谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)等；主要參與的細(xì)胞成分有氧谷氨酸脫氫酶復(fù)合物、過氧化物酶體和線粒體膜等；其分子功能主要與氧化還原酶活性、羧基裂解酶活性和糖代謝等有關(guān)。有研究[15]顯示，黃芪主要成分黃芪甲苷能夠通過PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞的分裂，且其抑制程度與黃芪甲苷的濃度呈正相關(guān)。同時，黃芪可能通過谷氨酰胺代謝、嘌呤化合物、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)等影響腫瘤細(xì)胞的DNA合成和能量代謝，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。黃芪甲苷可直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，黃芪抗腫瘤相關(guān)靶基因主要參與維甲酸信號通路、TP53調(diào)節(jié)代謝基因信號通路及葉酸代謝信號通路等，與既往研究結(jié)果一致。說明黃芪主要抗腫瘤成分黃芪甲苷可通過PI3K/Akt、維甲酸、TP53及葉酸代謝，影響腫瘤細(xì)胞DNA合成等方式抑制腫瘤發(fā)展。

癌癥的發(fā)生與機(jī)體免疫力降低、細(xì)胞免疫監(jiān)視功能減低有關(guān)。與正常細(xì)胞比較，腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一為凋亡抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞不斷分裂增殖而不發(fā)生分化。黃芪可提高機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體外研究[16]顯示，在肺腺癌細(xì)胞株A549中加入黃芪甲苷后細(xì)胞凋亡比例明顯上升，且G0/G1期細(xì)胞比例增高，提示黃芪甲苷具有明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用。本研究結(jié)果顯示，黃芪對宮頸癌，非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和胃癌等具有一定的抗腫瘤功效。參與黃芪抗腫瘤作用的關(guān)鍵基因包括POLR2A、POLR2D及POLR2G，且POLR2D基因高表達(dá)非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌患者生存期較短，POLR2D基因有望成為非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌患者預(yù)后分子標(biāo)志物。近期研究[17]發(fā)現(xiàn)，α-鵝膏蕈堿為基礎(chǔ)的抗體共軛藥物可以以POLR2A基因?yàn)榘悬c(diǎn)有效治療結(jié)直腸癌小鼠。POLR2A是一種包括癌細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞生存的必需基因，該基因的過表達(dá)對于腫瘤細(xì)胞的增殖至關(guān)重要。因此，抑制POLR2A基因表達(dá)能夠有效抑制腫瘤的發(fā)展。POLR2D、POLR2G與POLR2A為同一家族成員，其生物學(xué)功能上可能具有相似性，但需要進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，中藥黃芪抗腫瘤關(guān)鍵基因主要有POLR2A、POLR2D、POLR2G等基因，其生物學(xué)功能主要與谷氨酰胺代謝等有關(guān)、細(xì)胞成分主要富集于氧谷氨酸脫氫酶復(fù)合物等、分子功能主要參與氧化還原酶活性等，KEGG信號通路主要富集于維甲酸信號通路等。黃芪抗腫瘤基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中蛋白相互作用關(guān)系顯著。POLR2D高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌患者生存期較短有關(guān)。然而，本研究也存在一定的局限性，文章從生物信息學(xué)技術(shù)入手對黃芪的生物學(xué)功能、相關(guān)基因信號通路及腫瘤預(yù)后關(guān)系進(jìn)行了分析，但缺乏基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)外證據(jù)。因此，下一步應(yīng)進(jìn)一步完善相關(guān)研究，從體內(nèi)外分子水平進(jìn)一步探討黃芪的生物學(xué)功能，為其臨床應(yīng)用提供更為可靠的證據(jù)。