阮嘉莉，黃其春

廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021

糖皮質激素是臨床上應用范圍最廣的藥物之一。地塞米松是糖皮質激素典型的代表，適應證廣泛，用藥劑量差異大，任何劑量均存在不良作用，且劑量的大小和生長抑制之間存在直接關系[1]。多數(shù)研究[2]報道了地塞米松單用或配合抗癌藥物使用的合理性，但卻忽略地塞米松易隨病情的持續(xù)進展而加量長期使用，過量使用有可能會干預正常治療進程。皮質激素的大量使用可能會直接參與體內氧化應激反應從而產生細胞毒性[3]。最新研究[4]表明，慢性激素治療會通過改變人體相關基因，干擾體內正常的內分泌機制。臨床治療使用地塞米松來控制癌癥患者惡心嘔吐等不良作用的行為實際上可能會加重患者整體癥狀負擔[5]。研究報道，地塞米松具有潛在的藥物毒性，但是其毒性作用機制仍未明確。秀麗隱桿線蟲(下文簡稱線蟲)是第一個基因組序列基本上完整并且被全部測序的多細胞生物，其中有12/17種已知信號轉導途徑和人類是共同的，具有高度同源性[6]。線蟲生命周期短、結構簡單、身體透明、可大量繁殖，對藥物濃度變化高度敏感，現(xiàn)已用于毒理學研究[7]。不同于其他模型生物，線蟲還有獨立的中央基因組數(shù)據(jù)庫Worm Base[8]，可以直接選擇與應激反應相關的基因來評估溶液暴露的毒性。2017年12月～2018年10月，我們觀察了不同濃度地塞米松對線蟲生殖能力、運動能力及氧化脅迫相關基因如細胞色素P450家族蛋白基因(Cyp-35a2)、超氧化物歧化酶基因(Sod-1)、谷胱甘肽轉移酶基因(Gst-1)、細胞凋亡相關基因如類P-53蛋白基因(Cep-1)表達的影響，進一步探討地塞米松作用于生物體的毒性作用機制，為臨床用藥安全化、合理化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 野生型線蟲(N2)和線蟲食物大腸桿菌OP50由中國科學院昆明動物研究所梁斌老師惠贈；地塞米松磷酸鈉注射液購自天津金耀藥業(yè)有限公司；吖啶橙染色劑購自北京索萊寶有限公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成，逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒均購自Takara公司。體視顯微鏡(廣西梧州奧卡光學儀器有限公司)，SPX-70B型生化培養(yǎng)箱(上海邦西儀器科技有限公司)，電子分析天平(美國Thermo Forma公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 線蟲培養(yǎng) 線蟲置于含有食物OP50的NGM培養(yǎng)皿上，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用鉑絲針挑取年輕成蟲進行轉板傳代。當皿上含有大量蟲卵或者產卵高峰期的線蟲時，利用裂解液(現(xiàn)配現(xiàn)用，5 mol/L NaOH：5%NaClO=1∶2)處理蟲體。將余留的蟲卵置于M9液體中培養(yǎng)16 h為孵化的L1期幼蟲。將生長發(fā)育停滯在L1期的線蟲置于涂有OP50的NGM皿上繼續(xù)生長48 h，可得到L4同期化線蟲用于實驗。

1.3 地塞米松加入方法 結合本課題組的前期研究，在保證實驗濃度不導致線蟲死亡但可能會對正常生長發(fā)育造成影響的情況下，設立0、500、1 000、1 500、2 000 mg/L的5個濃度組(空白組、D1組、D2組、D3組、D4組)，利用K-medium溶液(32 mmol/L Kcl, 51 mmol/L Nacl)稀釋。采用液體暴露方法，將同步化后的L4期線蟲加入不同組中，20 ℃無菌恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。暴露結束后進行實驗。

1.4 線蟲生殖能力、運動能力觀察 生殖能力：隨機挑選暴露48 h的L4期線蟲置于含有OP50的NGM培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿上只放置1條線蟲，每24 h進行一次轉板直至線蟲不再產卵。記錄每次轉板時線蟲的子代數(shù)目，每條線蟲在產卵期得到子代數(shù)目的總和記為線蟲總產卵數(shù)。運動能力：隨機挑選暴露48 h的L4期線蟲，通過測定頭部擺動、身體彎曲、咽泵頻率來評估行為能力。測定頭部擺動需將線蟲挑至中央滴有60 μL M9緩沖液的NGM皿上，線蟲在緩沖液中自由適應1 min后，記錄20 s內線蟲頭部從一側擺向另外一側再擺動回來的次數(shù)。測定身體彎曲則將線蟲挑至無食物的NGM皿上自由恢復1 min后，記錄20 s內線蟲沿身體長軸方向爬行波長的次數(shù)。測定咽泵頻率需將線蟲置于含有OP50的NGM培養(yǎng)皿上，讓其在菌落上自由運動飲食1 min后，觀察20 s內線蟲咽泵跳動的次數(shù)。

1.5 線蟲細胞凋亡情況觀察 采用吖啶橙AO活體染色法[9]。將暴露于地塞米松環(huán)境后的L4期線蟲置于加有吖啶橙溶液(25 μg/mL)的孔板內，20 ℃避光培養(yǎng)2 h。結束后挑至無OP50的培養(yǎng)皿上恢復運動10 min，制備中央滴有左旋咪唑溶液(60 μg/mL)的2%瓊脂糖墊子載玻片，隨機挑取10～15條線蟲于咪唑溶液中麻醉，加以蓋玻片固定后，置于倒置熒光顯微鏡下拍照，激發(fā)波長為488 nm，顯微鏡下觀察線蟲身體各個部分細胞的凋亡情況。拍攝所得細胞凋亡熒光圖像利用Image J軟件處理，用相對熒光強度值表示細胞凋亡水平。

1.6 線蟲氧化脅迫相關基因Cyp-35a2、Cep-1、Sod-1、Gst-1檢測 采用實時熒光定量PCR法。使用TRIzol試劑標準化提取線蟲的總RNA，并測定在260 nm和280 nm波長處的光密度(OD)值，確保所提取RNA的純度在1.8～2.0。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，配制20 μL反應體系，進行實時熒光定量PCR檢測。以肌動蛋白基因(Act-1)作為內參基因，Cyp-35a2、Cep-1、Sod-1、Gst-1引物參考C.elegans數(shù)據(jù)庫(www.wormbase.org)檢索的序列進行設計，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以 2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 各組線蟲平均產卵量及運動能力變化 與空白組相比，D2組、D3組、D4組線蟲產卵數(shù)下降(P均<0.01)；D4組線蟲頭部擺動、身體彎曲能力、咽泵頻率降低(P均<0.01)。見表1。

表1 各組線蟲平均產卵量、頭部擺動、身體彎曲、咽泵頻率

2.2 各組線蟲細胞凋亡水平比較 染色后的正常細胞境下為淡綠色，而凋亡細胞由于DNA斷裂導致片段化增加，染色后呈現(xiàn)為亮綠色或者黃色[10]?？瞻捉M、D1組、D2組、D3組、D4組線蟲細胞相對熒光強度值分別為116.0±39.4、119.9±44.7、142.5±31.7、187.5±18.4、195.1±25.8。與空白組相比，D3、D4組增強了61%、68%(P均<0.05)。其熒光部位主要集中在線蟲咽部及身體前半部分。見圖1。

圖1 各組線蟲細胞凋亡熒光圖像

2.3 各組線蟲體內Sod-1、Cep-1、Cyp-35a2、Gst-1基因的相對表達量比較 與空白組比較，D1、D2、D3、D4組線蟲體內Sod-1基因相對表達量均升高(P均<0.01)；與空白組比較，D1、D2組線蟲體內Cep-1基因相對表達量升高，D3、D4組降低(P均<0.05)；與空白組比較，D1組Cyp-35a2基因相對表達量降低，D2、D3、D4組升高但無統(tǒng)計學意義；與空白組比較，D1、D2、D3、D4組Gst-1的相對表達量降低(P均<0.01)，詳見表2。

表2 各組線蟲體內Sod-1、Cep-1、Cyp-35a2、Gst-1基因的相對表達量

3 討論

人體長期、大劑量使用地塞米松時，會產生明顯的不良反應，包括心血管疾病增加、月經絮亂、骨質疏松等[11]。生命早期地塞米松暴露會對健康造成長期不利的后果[12]。已有研究[13]發(fā)現(xiàn)，地塞米松可誘導發(fā)育毒性。地塞米松在體內參與胰島素釋放和生物合成等多種反應，其效應取決于濃度和治療持續(xù)時間[14]，而地塞米松的安全劑量在很多時候是未知的。線蟲的生理功能(生殖率、運動行為)常被作為檢測藥物毒性的首選。它們分別反映外源環(huán)境對線蟲繁殖能力引起的生殖毒性和潛在的神經毒性，比LC50半致死濃度更為敏感[15]。

研究[16,17]發(fā)現(xiàn)，地塞米松產前暴露會降低大鼠卵巢體積和影響正常生育功能，通過干擾分泌內分泌激素直接影響卵巢貯備功能，地塞米松暴露后線蟲的生殖能力改變表明體內已經發(fā)生了內分泌的干擾。Heck等[18]研究了通過地塞米松誘導的抑郁樣表型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內細胞活性氧水平和NMDA R2A亞基水平的升高會導致小鼠神經細胞毒性，證實了地塞米松能誘導神經毒性改變。本研究結果顯示，與空白組相比，D2組、D3組、D4組線蟲產卵數(shù)下降；D4組線蟲頭部擺動、身體彎曲能力、咽泵頻率降低，提示高劑量地塞米松對線蟲的生殖毒性和神經毒性。細胞凋亡能夠反映線蟲體內細胞應對環(huán)境刺激的能力，地塞米松作為細胞凋亡誘導劑通過靶向不同的細胞內信號傳導途徑，誘導細胞凋亡和減少各種細胞的增殖[17,19]。本研究結果顯示，暴露在1 500 mg/L及以上濃度地塞米松的線蟲會出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，濃度越高細胞凋亡程度越明顯，結合同組線蟲生殖和運動能力的改變，推斷細胞凋亡可能是造成線蟲生殖及運動能力降低的一種潛在機制。

氧化脅迫相關基因表達量的改變代表了線蟲有害物質暴露后的各種應激反應或防御機制。Sod-1是生物體抗氧化自由基破壞的主超氧化物歧化酶[20]。當線蟲受到外源有害物質脅迫時，Sod-1基因通過上調來應對外源有害物質對器官造成的氧化損傷。Mutsaers等[21]研究表明，地塞米松暴露會通過改變多種線粒體編碼的基因表達呼吸鏈酶和抗氧化劑酶，誘導細胞活性氧增加，抑制抗氧化酶的活性，導致機體抗氧化系統(tǒng)減弱，更容易發(fā)生氧化應激和細胞損傷[22]。Gst-1基因表達物是一類可保護機體免受氧化損傷而具有解毒效果的多功能蛋白，主要參與抑制氧化應激[23]。線蟲極易受到外界氧化應激的影響，地塞米松可能通過氧化應激方式損傷線蟲機體，同時干擾線蟲解毒過程。外界氧化應激的影響超過線蟲自身能耐受的閾值，自身防御機制減弱甚至無法抵抗，使線蟲無法通過Gst結合產物來抑制各種氧化應激[24]。本研究結果顯示，與空白組比較，D1、D2、D3、D4組線蟲體內Sod-1基因相對表達量均升高；D1、D2、D3、D4組Gst-1的相對表達量均降低，Sod-1上調和Gst-1下調的同時存在，提示氧化應激是高濃度地塞米松導致線蟲生殖毒性及神經毒性的主要方式。

Cep-1是編碼哺乳動物P53腫瘤抑制蛋白的同源物的一種基因，與生物細胞凋亡情況密切相關[25]。本研究結果顯示，與空白組比較，D1、D2組線蟲體內Cep-1基因相對表達量升高，D3、D4組又降低，說明低濃度地塞米松中線蟲體內Cep-1顯著上調，通過促進細胞凋亡來響應氧化應激的壓力，協(xié)助Sod-1啟動機體防御機制維護機體穩(wěn)態(tài)。隨著地塞米松濃度的增加，Cep-1基因呈現(xiàn)出前后完全相反的改變，結合線蟲細胞凋亡水平的改變(D3組和D4組)，說明Cep-1基因表達變化與細胞凋亡程度改變的趨勢一致。有研究[26]表明，高劑量糖皮質激素會誘導蛋白質降解，通過增加蛋白在體內的周轉而影響乙酰膽堿酯酶活性。而Cyp-35a2基因的表達同時伴隨著乙酰膽堿的活性抑制[27]，間接影響線蟲的運動和發(fā)育。本研究中地塞米松僅誘導線蟲體內Cyp-35a2表達量的輕度上調，差異沒有統(tǒng)計學意義，提示其改變可能不是影響線蟲生理行為改變的主要因素。

綜上所述，1 500 mg/L濃度及以上的地塞米松對秀麗隱桿線蟲具有明顯的生殖毒性和神經毒性，其作用機制可與引起氧化應激和促使細胞凋亡有關，為臨床上地塞米松的合理應用提供了理論依據(jù)，更多有關病理劑量地塞米松介導的臨床不良反應所涉及的機制仍需進一步探討。