沈雪彬， 徐尚華, 林小端

近年來，隨著我國居民生活水平的提高及生活方式的轉(zhuǎn)變，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)和腦血管疾病等疾病已成為我國一大醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。迄今為止，冠心病的發(fā)病機制尚未完全闡明。如何防治動脈粥樣硬化成為研究難題[2]。過氧化物酶體增殖劑激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptorδ，PPARδ)是核激素受體家族中的配體激活受體，在糖和脂質(zhì)代謝中扮演重要角色。PPAR通過與視黃醇類X受體形成二聚體，結(jié)合上游啟動子區(qū)或編碼區(qū)內(nèi)的DNA應(yīng)答元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]，對代謝綜合征相關(guān)致病基因有潛在的調(diào)控作用[4]。載脂蛋白F(apolipoprotein F，ApoF)能選擇性抑制血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesterole stertransferprotein，CETP)的活性，其代謝異常與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、高脂血癥、動脈粥樣硬化等關(guān)系密切[5-6]。本研究擬通過構(gòu)建全長ApoF啟動子，觀察PPARδ激動劑對ApoF啟動子、mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響，為心腦血管疾病的防治提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 HepG2人肝癌細(xì)胞株由福建醫(yī)科大學(xué)消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室提供。限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(美國NEB公司)；PPARδ激動劑GW0742(美國Sigma公司)；魚精DNA、高保真Taq DNA聚合酶(美國Invitrogen公司)；胰酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒DNeasy Tissue Kit(美國Qiagen公司)；質(zhì)粒小量抽提試劑盒(上海超世生物科技有限公司)，質(zhì)粒大量抽提試劑盒(美國Qiagen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；ApoF特異性抗體(美國Pierce公司)；PPARδ抗體(美國Abcam公司)；內(nèi)參β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)；Realtime PCR及克隆構(gòu)建所需的引物及重組載體的測序(中國博尚生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1Realtime PCR定量檢測ApoF mRNA水平 細(xì)胞加入不同濃度PPAR激動劑GW0742干預(yù)細(xì)胞后，使用TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。內(nèi)參GAPDH，ApoF及PPARδ的引物序列見表1，其中GAPDH及ApoF引物序列由福建醫(yī)科大學(xué)消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室提供，PPARδ引物序列參考文獻(xiàn)[7]。

表1 內(nèi)參GAPDH，ApoF，PPARδ的引物序列

反應(yīng)體系為：PCR正向引物 0.4 μL；PCR反向引物0.4 μL；SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL；DNA模板2.0 μL；ddH2O 6.8 μL；總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.2.2Western-blot檢測PPARδ和ApoF蛋白表達(dá) 用預(yù)冷的PBS洗滌各組HepG2細(xì)胞3次，使用細(xì)胞裂解緩沖液于冰上裂解細(xì)胞5 min，收集至離心管中，經(jīng)超聲破碎后，加入上樣緩沖液電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，使用洗膜液洗滌2～3遍；加入一抗孵育20～30 min，繼續(xù)洗滌2～3遍，加入二抗，將PVDF膜放置暗盒中曝光，使用掃描儀掃描并分析圖片。

1.2.3ApoF啟動子重組載體構(gòu)建 從NCBI獲取ApoF啟動子全長序列，按照DNeasy Tissue Kit試劑盒說明提取HepG2細(xì)胞基因組DNA，使用高保真Taq DNA聚合酶擴增ApoF上游約2 000 bp的序列(ApoF的基因轉(zhuǎn)錄起始位點定為+1)，所獲得的PCR條帶經(jīng)測序公司測序并通過DNAMAN比對無誤。引物序列為：

正向：5′GGGGTACCCCCAACCTGAGCACTGCT3′

反向：5′CCGCTCGAGCCAAATTACCACACAGTCCAGTCATT3′

DNA回收試劑盒回收PCR擴增片段，電泳圖顯示條帶位置正確(圖2)。經(jīng)上海博尚生物技術(shù)有限公司測序無誤。構(gòu)建ApoF的啟動子全長命名為pGL3B-ApoF。

1.2.4雙熒光報告素酶基因檢測 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL3B-ApoF 48 h后，用細(xì)胞洗滌液洗滌已轉(zhuǎn)染pGL3B-ApoF基因的HepG2細(xì)胞，并吸凈殘留的洗滌液，加入裂解液裂解細(xì)胞10 min，并收集含pGL3B-ApoF及pGL3B的細(xì)胞裂解液置于干凈的EP管，離心取上清液至另一干凈的EP管。采用冷光儀(Orion Ⅱ Microplate Luminometer, Berthold Detection Systems)檢測熒光信號。pGL3B-ApoF組及陰性對照組所得熒光素酶活性值均除以各組的pRL-SV40熒光素酶活性值，以平衡各組的轉(zhuǎn)染效率，獲得相應(yīng)的熒光素酶校正值。結(jié)果以相對的熒光素酶活性值表示。每次轉(zhuǎn)染均做3個復(fù)孔，每次實驗至少重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件處理，采用方差分析比較GW0742干預(yù)后不同組間的熒光活性值及mRNA水平差別。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PPARδ激動劑干預(yù)HepG2細(xì)胞對ApoF mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響 HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度GW0742(0.1，1，10，25 μmol/L)及不同時間(24，48，72 h)處理后提取細(xì)胞RNA，Realtime PCR檢測PPARδ和ApoF的mRNA表達(dá)水平，以10 μmol/L的GW0742干預(yù)細(xì)胞24 h后，Western-blot檢測干預(yù)后的ApoF蛋白水平表達(dá)變化，其結(jié)果提示PPARδ被其激動劑GW0742激活后，ApoF mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05，圖1)。

A：不同濃度的GW0742對PPARδ mRNA表達(dá)水平的影響(a～e：對照組及0.1，1，10，25 μmol/L的GW0742濃度下對PPARδ mRNA表達(dá)水平的影響)； B：10 μmol/L GW0742條件下PPARδ及ApoF蛋白表達(dá)水平的影響； C：不同濃度GW0742條件下ApoF mRNA的水平(與陰性對照組、0.1 μmol/L及 1 μmol/L組比較，●：P<0.05；與10 μmol/L組比較，●●：P<0.05)； D：同一濃度不同時間GW0742條件下ApoF mRNA的水平(與陰性對照組比較，★：P<0.05).圖1 PPARδ激動劑對ApoF mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響Fig.1 PPARδ agonists affect the expression of Apolipoprotein F mRNA and protein

2.2ApoF啟動子全長基因構(gòu)建 通過NCBI獲取ApoF距離轉(zhuǎn)錄起始點上游約2 000 bp的啟動子序列，抽提HepG2基因組DNA，克隆ApoF基因啟動子全長，經(jīng)過KpnI和XhoI雙酶切鑒定及DNA測序，序列比對正確無誤，電泳圖顯示擴增產(chǎn)物位置正確(圖2)。

圖2 載脂蛋白F啟動子PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of Apolipoprotein F promoter

2.3PPAR激動劑對ApoF啟動子活性的影響 ApoF啟動子的雙熒光報告基因重組載體與內(nèi)參表達(dá)載體pRL-SV40共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并使用10 μmol/L的GW0742干預(yù)細(xì)胞24 h后檢測熒光素值。ApoF啟動子全長pGL3B-ApoF熒光素酶的熒光值設(shè)為1，對比干預(yù)之后熒光素值的變化，其結(jié)果顯示隨著GW0742濃度升高，pGL3B-ApoF熒光素酶的活性明顯下降。當(dāng)其濃度超過10 μmol/L時，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

與對照組比較，★：P<0.05.圖3 載脂蛋白F啟動子雙熒光報告素酶基因相對活性的變化Fig.3 The changes of the relative activity of the double fluorescent reporter enzyme gene of Apolipoprotein F promoter

3 討 論

文獻(xiàn)報道，PPARδ可以通過結(jié)合靶基因的啟動子進(jìn)一步促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)[8]。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ApoF的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)在啟動子上游1 618 bp范圍內(nèi)，并進(jìn)一步通過凝膠電泳遷移率及染色質(zhì)免疫共沉淀等實驗驗證了其受ETS-1/2和CEPα轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[9]。近期有研究提示，抑制ApoF的表達(dá)水平與非酒精性脂肪肝病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[10]。PPAR能調(diào)控ApoM和其他脂代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)，并扮演重要角色[11-12]。PPAR是否對ApoF產(chǎn)生影響尚不清楚。

本研究通過不同濃度的PPAR激動劑GW0742干預(yù)肝細(xì)胞，檢測ApoF的mRNA水平，結(jié)果提示PPARδ可以顯著降低肝細(xì)胞中ApoF的mRNA和蛋白表達(dá)水平。筆者進(jìn)一步構(gòu)建ApoF的全長啟動子，采用雙熒光素酶報告基因檢測ApoF啟動子活性的變化，結(jié)果顯示啟動子活性顯著降低，其結(jié)果與mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化一致；此外，通過TFsearch及NUBIScan等轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測ApoF上游啟動子區(qū)潛在的核受體結(jié)合位點，提示在上游啟動子區(qū)+43及+966存在高度匹配的結(jié)合位點，故PPARδ有可能通過競爭性地結(jié)合上游核受體結(jié)合位點，從而抑制ApoF的啟動子活性及表達(dá)。筆者推測，PPARδ可能通過調(diào)控ApoF的表達(dá)，進(jìn)而在非酒精性脂肪性肝病中扮演重要角色，其結(jié)果可為更有效預(yù)防和治療代謝綜合征等相關(guān)疾病提供有益借鑒。