王迪 黃小鳳 莫麗軍 蔣惟 向曉華 韋傳東

【摘要】 目的 研究乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ，MFG-E8）基因單核苷酸多態(tài)性在中國桂北地區(qū)漢族人群中的分布頻率及其在不同種族間分布的差異。

方法 采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR-RFLP）和DNA直接測序的方法檢測183例中國桂北地區(qū)漢族人群MFG-E8基因rs1878326C>A的位點(diǎn)，并結(jié)合人類基因組計(jì)劃（Hapmap）公布的五類人群（非洲人、美籍人、歐洲人、東亞人和南亞人）的SNP分型數(shù)據(jù)，比較分析這五類人群的基因型及等位基因的分布頻率。

結(jié)果 中國桂北地區(qū)漢族人群中MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)存在多態(tài)性，其基因型在男女性別間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;等位基因頻率在男女性別間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。rs1878326C>A位點(diǎn)的基因型與非洲人和美籍人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;而與歐洲人、東亞人及南亞人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論 中國桂北地區(qū)漢族人群中MFG-E8基因存在多態(tài)性，與非洲人和美籍人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種差異可能為其在不同疾病的研究提供前瞻性基礎(chǔ)資料。

【關(guān)鍵詞】 乳脂球表皮生長因子8; 單核苷酸多態(tài)性;基因型;基因頻率

中圖分類號：R446.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.02.004

【Abstract】 Objective To study the distribution frequency of single nucleotide polymorphism of milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ （MFG-E8） gene in Han population of Northern Guangxi and the difference of its distribution in different races.

Methods Restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction（PCR-RFLP） and direct DNA sequencing were used to detect the locus of MFG-E8 gene rs1878326C>A in 183 cases of Han population in North Guangxi，China.The genotypes and allele distribution frequency of five populations（African，American，European，East Asian，and South Asian） published by Human Genome Project（Hapmap） were compared and analyzed via SNP typing data.

Results Polymorphism was found in the rs1878326C>A locus of MFG-E8 gene in Han population in northern Guangxi，whereas no statistical significance existed in the genotype and allele frequency between genders （P>0.05）.Statistical significance was also found in the genotype of rs1878326C>A locus between Chinese and Africans and Americans; the frequency of allele distribution was statistically significant （P<0.05 or 0.01）;there was no significant difference between Chinese populations and those of Europeans，East Asians and South Asians （P>0.05）.

Conclusion Significant difference was observed in the polymorphism of MFG-E8 gene between Han population in northern Guangxi China and that in Africans and Americans，which may provide prospective basic data for its research in different diseases.

【Key words】 milk fat globule epidermal growth factor 8;single nucleotide polymorphism;genotype;gene frequency

乳脂球表皮生長因子8（milk fat globule epidermal growth factor Ⅷ，MFG-E8）是一種親脂性糖蛋白，分布在乳汁中的脂肪小球外表面。MFG-E8具有介導(dǎo)精-卵結(jié)合、增強(qiáng)吞噬清除凋亡細(xì)胞黏附、腸上皮細(xì)胞的維持與修復(fù)、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的外泌體功能、促進(jìn)乳腺分支形態(tài)發(fā)生、促進(jìn)附睪上皮細(xì)胞的維持和促進(jìn)血管形成等功能。MFG-E8基因位于人類15號染色體長臂2區(qū)5帶上（15q25），存在單核苷酸多態(tài)性。據(jù)報(bào)道顯示，MFG-E8基因多態(tài)性與法國人群老年性黃斑病變存在相關(guān)性，卻與德國人群老年性黃斑病變沒有相關(guān)性[1]。臺灣Hu等[2]報(bào)道MFG-E8基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1878326與系統(tǒng)性紅斑狼瘡存在相關(guān)性，中國內(nèi)地學(xué)者報(bào)道指出MFG-E8基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1878326 A等位基因能減少系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，分析統(tǒng)計(jì)MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在不同種族間的分布特點(diǎn)可為進(jìn)一步研究MFG-E8基因與多種疾病的關(guān)聯(lián)性提供理論數(shù)據(jù)及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

隨機(jī)選取2017年10月～2018年5月在桂林醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢的健康漢族人群183例，他們分別來自桂林市、賀州市、柳州市等地。其中男性110例，女性73例。年齡40～87歲，平均（57.32±9.39）歲，實(shí)驗(yàn)對象均無冠心病及血緣關(guān)系且各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)（肝、腎功能;血脂）均正常。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用亞能生物全血DNA提取試劑按說明書操作步驟進(jìn)行提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBIGenBank基因庫中人類MFG-E8基因（MFG-E8：NC_000015.10）rs1878326C>A位點(diǎn)多態(tài)性和DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，交由華大基因公司合成。用于特異性擴(kuò)增目的基因包含rs1878326C>A位點(diǎn)堿基DNA片段的引物其上游序列為5-ATTGTCCCTTTGTGGTCTTTGT-3，下游序列為：5-CGAGCCTTCTCTCCATTGC-3。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系

PCR擴(kuò)增體積為20 μL，其中10 μL 2×PCR Mix[2×Tag PCR Master Mix TIANGEN貨號：KT17120]，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán);72℃平衡10 min [Bio-rad基因擴(kuò)增儀s1000PCR擴(kuò)增儀]。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶

NlaⅢ [Thermo Fisher Scientific公司貨號：ER1831]。酶切反應(yīng)體系包括：PCR產(chǎn)物10 μL、10 X BufferG 2 μL、NlaⅢ 1 μL、雙蒸水18 μL。37℃酶切消化16小時(shí)，限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中結(jié)合DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量來對各種基因型進(jìn)行判斷并記錄酶切結(jié)果。

1.2.5 PCR產(chǎn)物直接測序

每個(gè)SNP位點(diǎn)隨機(jī)抽取4個(gè)交由華大基因公司進(jìn)行測序以驗(yàn)證限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)判斷的基因型是否正確。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，等位基因及基因型分布進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因型檢測結(jié)果

SNP分型結(jié)果顯示，rs1878326位點(diǎn)存在CC、CA和AA 3種基因型。MFG-E8基因rs1878326C>A多態(tài)性位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段大小和酶切產(chǎn)物大小見表1。瓊脂糖凝膠電泳條帶見圖1。DNA測序結(jié)果見圖2。

2.2 中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因多態(tài)性分布

MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明所選的研究樣本具有群體代表性。其中rs1878326C>A位點(diǎn)基因型以CA型多見，其等位基因以C型頻率最高，占56.0%。中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)存在多態(tài)性，而這種多態(tài)性的基因型頻率及等位基因頻率在男女性別間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 MFG-E8 基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布比較

中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因rs1878326C>A多態(tài)性分布頻率與人類基因組計(jì)劃 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）公布的五類人群（非洲人、美籍人、歐洲人、東亞人和南亞人）的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因rs1878326C>A多態(tài)性基因型和等位基因的分布頻率與非洲人和美籍人比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01），而與歐洲人、東亞人和南亞人比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

乳脂球表皮生長因子8是由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞合成分泌的磷脂酰絲氨酸與整聯(lián)蛋白結(jié)合的糖蛋白，其在哺乳動物上皮細(xì)胞、附睪上皮、血管平滑肌、腸黏膜的巨噬細(xì)胞中均有表達(dá)[4～6]。在人類中表達(dá)的MFG-E8長約53 kDa，在蛋白質(zhì)的成熟中發(fā)揮著重要的作用。MFG-E8的N-端是由兩個(gè)類表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）所構(gòu)成的重復(fù)序列，有1個(gè)精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）序列位于第2個(gè)EGF上，RGD能夠與位于細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白二聚體結(jié)合，介導(dǎo)整合素受體αvβ3、αvβ5相關(guān)信號傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞之間的黏附、增殖、分化及凋亡[7～8]。編碼MFG-E8的基因定位于人類的15號染色體長臂上。MFG-E8在許多疾病的病理生理過程中起作用。據(jù)報(bào)道在胃腸缺血-再灌注損傷小鼠模型中起到保護(hù)腸道的屏障作用[9]。誘導(dǎo)缺乏MFG-E8的小鼠形成動脈粥樣硬化，可發(fā)現(xiàn)小鼠凋亡細(xì)胞的吞噬作用顯著降低，發(fā)生動脈粥樣硬化的病變部位顯著擴(kuò)大[10]。在Alzheimers病的發(fā)生發(fā)展中，當(dāng)MFG-E8表達(dá)不足或水平較低，凋亡細(xì)胞不能被及時(shí)清除，誘發(fā)了Alzheimers的產(chǎn)生以及加速其惡化[11]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由于單個(gè)核苷酸的改變所引起的DNA序列多態(tài)性。MFG-E8基因存在SNP，并且某些位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與一些疾病存在相關(guān)性。在MFG-E8基因rs1878326 A>C位點(diǎn)中rs1878326 A等位基因和CA基因型能降低中國人群患系統(tǒng)紅斑狼瘡的風(fēng)險(xiǎn)。也有報(bào)道顯示rs1878326 C等位基因增加法國老年性黃斑變性的風(fēng)險(xiǎn)。因此分析MFG-E8基因多態(tài)性在不同種群中的分布特點(diǎn)可以為研究其與疾病的相關(guān)性提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR-RFLP）和DNA直接測序的方法檢測了中國桂北地區(qū)漢族人群MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)多態(tài)性分布情況，結(jié)果顯示，rs1878326C>A位點(diǎn)表現(xiàn)出CC、CA、AA三種基因型，其所占頻率分別為31.7%、48.6%、19.7%。等位基因C和A所占頻率為56.0%和44.0%。將中國桂北地區(qū)漢族人與非洲人、美籍人、歐洲人、東亞人和南亞人的基因多態(tài)性研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)CC基因型頻率和C等位基因頻率顯著低于非洲人（64.2%、80.1%）而高于美籍人（14.4%、38.0%）。中國桂北地區(qū)漢族人MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)AA基因型頻率和A等位基因頻率顯著高于非洲人（3.9%、19.9%）而顯著低于美籍人（38.4%、62.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而與歐洲人、東亞人和南亞人比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，MFG-E8基因rs1878326C>A位點(diǎn)基因型分布及等位基因頻率在不同種族間有著顯著差異，這為以后研究與MFG-E8基因相關(guān)疾病在不同種族和區(qū)域之間的差異奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)且提供了分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-10-15 修回日期：2019-12-09）

（編輯：梁明佩）