唐斌+黃丹+傅強(qiáng)

[摘要] 目的 分析SLCO1B1的主要突變388G>A和521T>C在南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥人群中的分布。 方法 分別采用PCR-RFLP和ARMS-PCR方法對280名居住于南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥患者SLCO1B1的388G>A和521T>C位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并對其進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。 結(jié)果 280名受試者中，SLCO1B1的388G>A位點(diǎn)：110名為388G>A突變雜合子，141名為388G突變純合子，分別占總?cè)藬?shù)的39.3%和50.3%，余29名為388A野生型純合子，占總?cè)藬?shù)的10.4%，突變等位基因的發(fā)生頻率為70.0%。521T>C位點(diǎn)：60名為521T>C突變型雜合子，6名為521C突變型純合子，分別占總?cè)藬?shù)的21.4%和2.1%，余214名為521T野生型純合子，占總?cè)藬?shù)的76.5%，突變等位基因的發(fā)生頻率為12.9%。 結(jié)論 南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥人群中的SLCO1B1 388G>A和521T>C突變與日本及中國漢族男性健康人群分布相似，388G>A突變率顯著高于白人，521T>C突變率顯著高于黑人。

[關(guān)鍵詞] SLCO1B1；基因型；原發(fā)性高脂血癥

[中圖分類號] R394 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）34-0001-03

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP1B1是一種表達(dá)在竇狀隙基底側(cè)細(xì)胞膜上的攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)體，為具有基因多態(tài)性的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1，2] ，由SLCO1B1基因編碼，它主要分布于人的肝臟，其他還可見于腎臟、腦、小腸等器官，具有介導(dǎo)肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)、外源性物質(zhì)并對其進(jìn)行代謝和消除的生理功能。轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)包括他汀類、降糖藥、利福平、血管緊張素Ⅱ 受體拮抗劑和膽汁酸、非結(jié)合型膽紅素、甲狀腺素、PGE和某些肽類[3]，Hirouchi M[4]等和Chung JY等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SLCO1B1多態(tài)性在OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能和藥代動力學(xué)個(gè)體差異上起著重要作用。日本研究者報(bào)道，388G>A和521T>C是其人群中常見基因突變，頻率分別為66%和15.8%[6]。然而關(guān)于南昌地區(qū)原發(fā)性高脂血癥人群中的情況分別未見報(bào)道，本文擬對此作一研究，以期為原發(fā)性高脂血癥患者藥效和藥動學(xué)的個(gè)體差異提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

參考《血脂異常防治建議》從江西省人民醫(yī)院2013 年7～12月門診就診患者中篩選280名居住于南昌地區(qū)漢族無血源關(guān)系原發(fā)性高脂血癥患者，男132例，女148例，年齡33～70 （55.8±9.2）歲；身高144～184（163.6±8.6）cm；體重40～90（66.6±10.5）kg。

1.2 方法

1.2.1 材料 引物：南昌長城生物科技有限公司合成；DNA 提取試劑：美國Pel-Freez 公司；LA Taq DNA 聚合酶，Taq DNA 聚合酶，限制性內(nèi)切酶TaqI及dNTP （MBI Fermentas，Lithuania）：深圳晶美生物工程有限公司。

1.2.2 DNA抽提 采取受試者清晨空腹外周EDTA抗凝靜脈血5 mL，以DNA提取試劑盒提取外周血DNA。

1.2.3 基因分型 參考基因分型優(yōu)化文獻(xiàn)[7]。

1.2.3.1 388G>A分型：采用PCR-RFLP進(jìn)行：其引物為：F：5-ATAATGGTGCAAATAAAGGGG-3，R：5-ACTATCTCAGGTGATGCTCTA-3。反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Master Mix 2.5 μL，DNA模板約200 ng，前后引物各40 pmol/L，Taq酶2.0 U，0.4 mmol/L dNTP，余額體積補(bǔ)充純水完成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃30 s，44℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min。388G>A 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.5%的瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型。擴(kuò)增產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系：10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 μL的Taq I 酶，1 μL 10×H Master Mix，3 μL純水，65℃溫育4 h。2.5%的瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型。

1.2.3.2 521T>C 分型：以ARMS-PCR方法進(jìn)行分型。引物：OuterP1：5-AAGTAGTTAAATTTGTAATAGAAATGC-3，InnerP1：5-GGGTCATACATGTGGATATAAGT-3，InnerP2：5-AAGCATATTACCCATGAACG-3，OuterP2：-GTAGACAAAGGGAAAGTGATCATA-3，反應(yīng)體系（25 μL）：10×PCR Master Mix 2.5μL，Taq酶2U，dNTP 0.4 mmol/L，hDNA模板200 ng，各引物均為40 pmol/L，余額取純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。2.5%的瓊脂糖凝膠對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用頻率計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型頻率及等位基因頻率，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定

388G>A基因：如圖1： 2.5%的瓊脂糖凝膠電泳拍照圖所示：突變型雜合子：23bp、63bp、123bp與151bp等4處顯示亮帶；突變型純合子：23bp 、63bp及128bp等3處顯示亮帶，野生型純合子：63bp和151bp 2處顯示亮帶。521T>C基因：如圖2：2.5%的瓊脂糖凝膠電泳拍照圖所顯：突變型雜合：123bp、179bp與260bp等3處顯示亮帶；突變型純合子：123bp 和260bp 2處顯示亮帶；野生型純合子：179bp和 260bp 2處顯示亮帶。

2.2 基因型分布及等位基因頻率分布

基因型和各等位基因的頻率如表1。280名南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥患者中，388G>A：檢測出29例受試者為野生型純合子，占總?cè)藬?shù)的10.4%；突變純合子141例，占比為50.3%；其余110例是比例為39.3%的突變雜合子，等位基因突變發(fā)生率為70.0%。521T>C：檢測出214例野生型純合子，占總?cè)藬?shù)的76.5%；6例突變型純合子，占2.1%，余60例突變型雜合子，占總?cè)藬?shù)的21.4%，等位基因突變發(fā)生率為12.9%。兩基因觀察值符合Hardy-weinberg 遺傳平衡。表明本研究資料具有群體代表性（P=0.31和P=0.94）。

3 討論

目前大多研究證實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)體及藥物代謝酶的遺傳多態(tài)性與藥物相互作用的個(gè)體差異具有重要的相關(guān)性。近年來體內(nèi)或體外研究證明攝入型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP1B1在藥物底物的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝起著重要的作用。目前在不同研究人群中各國研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SLCO 1B1基因（編碼OATP1B1蛋白）多達(dá)20種基因突變[7]。當(dāng)前研究多集中在常見的兩個(gè)突變位點(diǎn)，位于第5外顯子的388A>G與第6外顯子的521T>C，上述兩個(gè)位點(diǎn)的突變明顯影響許多底物的轉(zhuǎn)運(yùn)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)速度及與底物結(jié)合力。

本文將南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥人群388G>A與521T>C等位基因突變分布情況與報(bào)道的中國漢族男性健康、歐美和日本人群作一比較：本研究388G>A等位基因突變頻率為70.0%，顯著高于白人30%的突變率（P<0.05），與報(bào)道中國漢族男性健康人群（73.4%）、黑人（74%）及日本人群（62.9%）之間無顯著差異（P>0.05）。在本研究中521T>C等位基因突變率為12.9%，顯著高于黑人的2%的突變率（P<0.05），與報(bào)道中國漢族男性健康人群（14.0%）、白人（14%）及日本人群（15.8%）之間無顯著差異（P>0.05）[6，8，9]。上述結(jié)果表明，在不同人群中388G>A和521T>C突變率不同種族間具有顯著的差異。

目前多數(shù)報(bào)道顯示，SLCO1B1基因多態(tài)性明顯影響其參與轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的藥效動力學(xué)、藥物毒性以及藥代動力學(xué)[10]。如目前報(bào)道的廣泛應(yīng)用于高脂血癥治療的HMG-CoA還原酶抑制劑瑞舒伐他汀，其被SLCO1B1轉(zhuǎn)運(yùn)入肝而行調(diào)脂作用，熊玉卿等[11]研究報(bào)道，521T>C 位點(diǎn)突變影響瑞舒伐他汀藥代動力學(xué)，使其轉(zhuǎn)運(yùn)體活性下降，增高血藥濃度，可能與突變后增加瑞舒伐他汀在人體內(nèi)的吸收程度，減慢消除過程有關(guān)。國外日本與德國研究者分別報(bào)道顯示，521T>C野生型純合子組血藥濃度顯著低于突變組，而其非腎清除率顯著高于突變組。而對于388G>A的突變是否影響藥效動力學(xué)、藥代動力學(xué)目前研究結(jié)論不一致。德國研究者報(bào)道，388G>A突變組普伐他汀血藥濃度顯著升高，然而較多數(shù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)未見該突變的上述影響[12，13]。而在關(guān)于非結(jié)合膽紅素水平的研究中，日本、臺灣與中國大陸的研究者報(bào)道SLCO1B1521T>C突變導(dǎo)致個(gè)體血漿濃度明顯高于非突變?nèi)巳篬7，14，15]。以上顯示，SLCO1B1基因多態(tài)性顯著影響某些藥物的藥代動力學(xué)及藥物濃度，其研究對于臨床個(gè)體化用藥具有重要指導(dǎo)意義，如臨床醫(yī)師在使用涉及到該兩個(gè)突變基因參與轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的底物如他汀類，抗結(jié)核藥及降糖等藥物時(shí)， 應(yīng)參考其基因型檢測結(jié)果，以期提高藥物療效及減少副作用。

綜上所述：在南昌地區(qū)漢族原發(fā)性高脂血癥人群中SLCO1B1的388G>A和521T>C突變比較常見，其突變率與日本、中國漢族男性健康人相近，與報(bào)道的白人和黑人頻率有顯著差異，提示其突變率可能與原發(fā)性高脂血癥發(fā)病無關(guān)，但可能與種族有關(guān)，此種差異可能是遺傳因素與環(huán)境因素等多因素的相互作用結(jié)果，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Takanohashi T，Kubo S，Arisaka H，et al. Contribution of organic anion transporting polypeptide（OATP） 1B1 and OATP1B3 to hepatic uptake of nateglinide，and the prediction of drug-drug interactions via these transporters[J]. J Pharm Pharmacol，2012，64（2）：199-206.

[2] Herfindal L，Krakstad C，Myhren L，et al. Introduction of aromatic ring-containing substituents in cyclic nucleotides is associated with inhibition of toxin uptake by the hepatocyte transporters OATP 1B1 and 1B3[J]. PLoS One，2014， 9（4）：e94966.

[3] Khurana V，Minocha M，Pal D，et al. Role of OATP-1B1 and/or OATP-1B3 in hepatic disposition of tyrosine kinase inhibitors[J]. Drug Metabol Drug Interact，2014，29（3）：179-190.

[4] Hirouchi M，Kusuhara H，Onuki R，et al. Construction of triple-transfected cells[organic anion-transporting polypeptide （OATP）1B1/multidrug resistance-associated protein （MRP） 2/MRP3 and OATP1B1/MRP2/MRP4] for analysis of the sinusoidal function of MRP3 and MRP4[J]. Drug Metab Dispos，2009，37（10）：2103-2111.

[5] Chung JY，Cho JY，Yu KS，et al. Effect of OATP1B1 （SLCO1B1） variant alleles on the Pharmacokinetics of pitavastatin in healthy volunteers[J]. Clin Pharmacol Ther，2005，78（4）：342-350.

[6] Nishizato Y，I Ieiri，Suzuki H，et al. Polymorphisms of OATP-C （SLC21A6） and OAT3 （SLC22A8） genes： consequences for pravastatin pharmacokinetics[J]. Clin PHarmacol，Ther，2003，73（6）：554-565.

[7] Zhang W，He YJ，Gan Z.et al. OATP1B1 polymorphism is a major determinant of serum bilirubin level but not associated with rifampicin-mediated bilirubin elevation[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol ，2007，34（12）：1240-1244.

[8] Furihata T1，Satoh N，Ohishi T，et al. Functional analysis of a mutation in the SLCO1B1 gene （c.1628T>G） identified in a Japanese patient with pravastatin-induced myopathy. Pharmacogenomics J[J]. 2009，9（3）： 185-193

[9] Xu LY，He YJ，Zhang W，et al. Organic anion transporting polypeptide-1B1 haplotypes in Chinese patients[J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28（10）：1693-1697.

[10] Nies AT，Niemi M，Burk O，et al. Genetics is a major determinant of expression of the human hepatic uptake transporter OATP1B1，but not of OATP1B3 and OATP2B1[J].Genome Med ，2013，5 （1）： 1.

[11] 熊玉卿、袁釗、溫金華、等. OATP1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性與瑞舒伐他汀的關(guān)聯(lián)[J]. 江西醫(yī)藥，2012，47（5）：421-424.

[12] Gerloff T，Schaefer M，Mwinyi J，et al. Influence of the SLCO1B1*1b and *5 haplotypes on pravastatin's cholesterol lowering capabilities and basal sterol serum levels[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2006，373（1）：45-50.

[13] Niemi M，Schaeffeler E，Lang T，et al. High plasma pravastatin concentrations are associated with single nucleotide polymorpHisms and haplotypes of organic anion transporting polypeptide-C （OATP-C，SLCO1B1）[J]. Pharmacogenetics，2004，14（7）：429-440.

[14] Cui Y，K？nig J，Leier I，et al. Hepatic Uptake of Bilirubin and Its Conjugates by the Human Organic Anion Transporter SLC21A6[J]. J Biol Chem，2001，276（13）： 9626–9630.

[15] Ieiri I，Suzuki H，Kimura M，et al. Influence of common variants in the pharmacokinetic genes（OATP-C，UGT1A1，and MRP2） on serum bilirubin levels in healthy subjects[J].Hepatol Res ，2004，30（2）：91-95.

（收稿日期：2014-09-24）

[5] Chung JY，Cho JY，Yu KS，et al. Effect of OATP1B1 （SLCO1B1） variant alleles on the Pharmacokinetics of pitavastatin in healthy volunteers[J]. Clin Pharmacol Ther，2005，78（4）：342-350.

[6] Nishizato Y，I Ieiri，Suzuki H，et al. Polymorphisms of OATP-C （SLC21A6） and OAT3 （SLC22A8） genes： consequences for pravastatin pharmacokinetics[J]. Clin PHarmacol，Ther，2003，73（6）：554-565.

[7] Zhang W，He YJ，Gan Z.et al. OATP1B1 polymorphism is a major determinant of serum bilirubin level but not associated with rifampicin-mediated bilirubin elevation[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol ，2007，34（12）：1240-1244.

[8] Furihata T1，Satoh N，Ohishi T，et al. Functional analysis of a mutation in the SLCO1B1 gene （c.1628T>G） identified in a Japanese patient with pravastatin-induced myopathy. Pharmacogenomics J[J]. 2009，9（3）： 185-193

[9] Xu LY，He YJ，Zhang W，et al. Organic anion transporting polypeptide-1B1 haplotypes in Chinese patients[J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28（10）：1693-1697.

[10] Nies AT，Niemi M，Burk O，et al. Genetics is a major determinant of expression of the human hepatic uptake transporter OATP1B1，but not of OATP1B3 and OATP2B1[J].Genome Med ，2013，5 （1）： 1.

[11] 熊玉卿、袁釗、溫金華、等. OATP1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性與瑞舒伐他汀的關(guān)聯(lián)[J]. 江西醫(yī)藥，2012，47（5）：421-424.

[12] Gerloff T，Schaefer M，Mwinyi J，et al. Influence of the SLCO1B1*1b and *5 haplotypes on pravastatin's cholesterol lowering capabilities and basal sterol serum levels[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2006，373（1）：45-50.

[13] Niemi M，Schaeffeler E，Lang T，et al. High plasma pravastatin concentrations are associated with single nucleotide polymorpHisms and haplotypes of organic anion transporting polypeptide-C （OATP-C，SLCO1B1）[J]. Pharmacogenetics，2004，14（7）：429-440.

[14] Cui Y，K？nig J，Leier I，et al. Hepatic Uptake of Bilirubin and Its Conjugates by the Human Organic Anion Transporter SLC21A6[J]. J Biol Chem，2001，276（13）： 9626–9630.

[15] Ieiri I，Suzuki H，Kimura M，et al. Influence of common variants in the pharmacokinetic genes（OATP-C，UGT1A1，and MRP2） on serum bilirubin levels in healthy subjects[J].Hepatol Res ，2004，30（2）：91-95.

（收稿日期：2014-09-24）

[5] Chung JY，Cho JY，Yu KS，et al. Effect of OATP1B1 （SLCO1B1） variant alleles on the Pharmacokinetics of pitavastatin in healthy volunteers[J]. Clin Pharmacol Ther，2005，78（4）：342-350.

[6] Nishizato Y，I Ieiri，Suzuki H，et al. Polymorphisms of OATP-C （SLC21A6） and OAT3 （SLC22A8） genes： consequences for pravastatin pharmacokinetics[J]. Clin PHarmacol，Ther，2003，73（6）：554-565.

[7] Zhang W，He YJ，Gan Z.et al. OATP1B1 polymorphism is a major determinant of serum bilirubin level but not associated with rifampicin-mediated bilirubin elevation[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol ，2007，34（12）：1240-1244.

[8] Furihata T1，Satoh N，Ohishi T，et al. Functional analysis of a mutation in the SLCO1B1 gene （c.1628T>G） identified in a Japanese patient with pravastatin-induced myopathy. Pharmacogenomics J[J]. 2009，9（3）： 185-193

[9] Xu LY，He YJ，Zhang W，et al. Organic anion transporting polypeptide-1B1 haplotypes in Chinese patients[J]. Acta Pharmacol Sin，2007，28（10）：1693-1697.

[10] Nies AT，Niemi M，Burk O，et al. Genetics is a major determinant of expression of the human hepatic uptake transporter OATP1B1，but not of OATP1B3 and OATP2B1[J].Genome Med ，2013，5 （1）： 1.

[11] 熊玉卿、袁釗、溫金華、等. OATP1B1 轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性與瑞舒伐他汀的關(guān)聯(lián)[J]. 江西醫(yī)藥，2012，47（5）：421-424.

[12] Gerloff T，Schaefer M，Mwinyi J，et al. Influence of the SLCO1B1*1b and *5 haplotypes on pravastatin's cholesterol lowering capabilities and basal sterol serum levels[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2006，373（1）：45-50.

[13] Niemi M，Schaeffeler E，Lang T，et al. High plasma pravastatin concentrations are associated with single nucleotide polymorpHisms and haplotypes of organic anion transporting polypeptide-C （OATP-C，SLCO1B1）[J]. Pharmacogenetics，2004，14（7）：429-440.

[14] Cui Y，K？nig J，Leier I，et al. Hepatic Uptake of Bilirubin and Its Conjugates by the Human Organic Anion Transporter SLC21A6[J]. J Biol Chem，2001，276（13）： 9626–9630.

[15] Ieiri I，Suzuki H，Kimura M，et al. Influence of common variants in the pharmacokinetic genes（OATP-C，UGT1A1，and MRP2） on serum bilirubin levels in healthy subjects[J].Hepatol Res ，2004，30（2）：91-95.

（收稿日期：2014-09-24）