唐 林，黎宗寶，白瑞娜

（1. 海南省人民醫(yī)院中醫(yī)科，海南 ?？?570311； 2. 海南省人民醫(yī)院急救中心，海南 海口 570311；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100091）

血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能改變與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。董霄等[2]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)中氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）代謝異常是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和平滑肌細(xì)胞增生的重要危險(xiǎn)因素。體內(nèi)OX-LDL過量時(shí)可導(dǎo)致膽固醇沉積于動(dòng)脈血管壁，增加動(dòng)脈硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。李婷等[4]研究發(fā)現(xiàn)，OX-LDL 可通過抑制Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）自噬。細(xì)胞自噬是在自噬相關(guān)基因調(diào)控下利用溶酶體降解受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程[5]。丹參酮ⅡA為丹參提取物，具有擴(kuò)張血管、降血壓、抗血栓的功效，對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制作用顯著[6]。本研究中探討了丹參酮ⅡA對(duì)OXLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVEC 細(xì)胞（上海紀(jì)寧生物科技有限公司，批號(hào)為JN-B1888）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號(hào)為11966025）；10% 胎牛血清（美國Gibco 公司，貨號(hào)為10099-141）；0.25%胰酶細(xì)胞消化液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為C0201）；乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)為YT412）；OX -LDL（美國Solarbio 公司，批號(hào)為H7950，規(guī)格為2 mg）；丹參酮ⅡA（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào)為P0019）；硫代巴比妥酸（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)為20170209）；rad680 型酶標(biāo)儀（美國Bio 公司）；黃嘌呤氧化酶（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為MB3079）；單丹磺酰戊二胺（MDC，上海懋康生物科技有限公司，批號(hào)為MX-4453）；山羊血清（美國Solarbio 公司，批號(hào)為SL038）；兔抗MAP1LC3[2]B 抗體（艾美捷科技有限公司，批號(hào)為R-155-100）；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京碧云天生物科技有限公司，批號(hào)為A0216）；DAPI 染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為DA0001）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)及處理：將HUVEC 接種于含DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件為37 ℃及5%CO2，每2 d 換液1 次，并進(jìn)行傳代，直至細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期。取出細(xì)胞加入0.25%胰酶細(xì)胞消化液和EDTA溶液消化細(xì)胞。

丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定：將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（A 組）、OX-LDL 處理組[25 mg/L（B1組）、50 mg/L（B2組）、75 mg/L（B3組）、100 mg/L（B4組）]、B4組+丹參酮ⅡA處理組[0 mg/L（C1組）、0.5 mg/L（C2組）、1.0 mg/L（C3組）、1.5 mg/L（C4組）]，分別處理24h 后測(cè)定細(xì)胞中MDA 和SOD 含量。

將50 μL 硫代巴比妥酸加入各組細(xì)胞中，充分混勻后95 ℃下水浴40 min，冷卻后離心10 min（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min），取上清液在532 nm 波長處利用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算MDA 相對(duì)含量。將20 μL 黃嘌呤氧化酶加入各組細(xì)胞中，充分混勻后37 ℃下孵育20 min，測(cè)定其在450 nm 波長處的吸光度，計(jì)算SOD 活力。

細(xì)胞自噬：取A 組和各組細(xì)胞比較陽性細(xì)胞比例。細(xì)胞置離心儀離心5 min（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min），加入磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，棄去上清液，再加入PBS 溶液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL；取適量細(xì)胞懸液置新EP 管中，加入50 μmol/L 單丹磺酰戊二胺，室溫避光染色30 min；PBS 清洗3 次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察其在355 nm 處的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

自噬小體表達(dá)：取B4組細(xì)胞，分別用0，0.5，1.0，1.5 mg/L 丹參酮ⅡA處理，比較各組細(xì)胞陽性細(xì)胞比例，并觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象。每組細(xì)胞取3 份接種于24 孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)107，室溫孵育24 h；滴加封閉山羊血清，室溫封閉20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶200 的比例加入兔抗MAP1LC3[3]B 抗體，4 ℃下過夜，PBS 清洗3 次，每次5 min；以1 ∶500 的比例加入HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L），室溫靜置1 h，PBS 溶液清洗3 次，每次5 min；加DAPI 染色液染色5 min，顯微鏡下觀察染色情況，PBS 清洗3 次，每次5 min；甘油封片后利用熒光倒置顯微鏡觀察自噬小體。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。危險(xiǎn)因素采用Logistic 回歸分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA 含量及SOD 活力

與A 組比較，B 組MDA 含量明顯升高（F=493.724，P ＜0.05），SOD 活力明顯降低（F=9.770，P ＜0.05）；隨著OX-LDL 劑量增加，B 組MDA 含量逐漸升高（F=151.508，P ＜0.05），SOD 活力逐漸下降（F=6.035，P ＜0.05）；與B4組比較，隨著丹參酮ⅡA劑量增加，MDA 含量逐漸減少（F=374.014，P ＜0.05），SOD 活力逐漸增加（F=5.621，P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組MDA 含量及SOD 活力比較（±s，n=3）

表1 各組MDA 含量及SOD 活力比較（±s，n=3）

注：與A 組比較，*P ＜0.05；與B4 組比較，#P ＜0.05。

組別A 組B1 組B2 組B3 組B4 組MDA 含量（nmol/mL）1.68±0.12 4.57±0.15*5.74±0.18*6.52±0.21*7.87±0.23*SOD 活力（mU/mL）101.14±13.45 84.24±10.26*72.12±9.64*63.45±9.57*51.54±9.46*組別C1 組C2 組C3 組C4 組MDA 含量（nmol/mL）6.68±0.24#5.13±0.21#3.12±0.24#1.87±0.18#SOD 活力（mU/mL）68.97±12.87#76.57±13.54#86.45±13.73#97.42±13.57#

2.2 OX-LDL 對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響

與A 組比較，隨著OX-LDL 劑量增加，細(xì)胞自噬水平逐漸上升（P ＜0.05）；不同OX-LDL 劑量陽性細(xì)胞比例分別為19.3%，27.1%，34.6%，45.3%，與A 組（5.2%）比較，陽性細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 丹參酮ⅡA 對(duì)OX-LDL 處理細(xì)胞自噬水平的影響

隨著丹參酮ⅡA劑量增加，細(xì)胞自噬水平逐漸下降（P ＜0.05）；不同丹參酮ⅡA劑量處理陽性細(xì)胞比例分別為43.5%，30.6%，23.6%，17.6%，與B4組（45.3%）比較，陽性細(xì)胞比例明顯降低（P ＜0.05）。詳見圖2。

2.4 細(xì)胞自噬現(xiàn)象

通過OX-LDL 處理后，細(xì)胞形成LC3 自噬小體，細(xì)胞自噬水平上升；丹參酮ⅡA干預(yù)后，細(xì)胞中LC3 自噬小體減少，細(xì)胞自噬水平下降。詳見圖3。

圖1 不同劑量OX-LDL 對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響

圖2 不同劑量丹參酮ⅡA 對(duì)OX-LDL 處理細(xì)胞自噬水平的影響

圖3 各組細(xì)胞自噬現(xiàn)象

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)病基礎(chǔ)與脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)，其中OX-LDL 為導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的主要原因[7]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AS 與氣虛、血瘀、痰濁有關(guān)[8]，故中醫(yī)治療常以活血化瘀為主[9]。丹參為常用中藥材，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛的功效。丹參酮ⅡA為丹參提取物之一。陳少秀等[10]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可提高腎移植術(shù)后大鼠體內(nèi)SOD 活性，抑制MDA 產(chǎn)生，抑制其腎小管上皮細(xì)胞凋亡，達(dá)到腎缺血再灌注損傷防護(hù)作用。

正常情況下，體內(nèi)氧自由基反應(yīng)與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)是維持體內(nèi)新陳代謝的重要機(jī)制，動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)可引起新陳代謝失常及免疫功能下降，破壞生物膜及其功能，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化可產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，改變細(xì)胞膜流動(dòng)性及通透性，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。SOD 是體內(nèi)的活性物質(zhì)，能清除新陳代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)。體內(nèi)LDL 經(jīng)氧化修飾后可形成OX-LDL，OX-LDL 通過引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可產(chǎn)生多種反應(yīng)性醛。本研究中通過OX-LDL 處理HUVEC細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著OX-LDL 劑量的增加，細(xì)胞MDA 含量逐漸升高，SOD 活力逐漸下降，表明OX-LDL 對(duì)血管內(nèi)皮有損傷作用，并能使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。葉張章等[11]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者AS 的發(fā)生、發(fā)展與患者血清中膽紅素水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。郝陽等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可促進(jìn)細(xì)胞自噬水平的升高，自噬水平上升可導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡而引發(fā)疾病。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象時(shí)，附著于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無核糖體的雙層膜包裹的胞質(zhì)與細(xì)胞中降解的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)成分可形成自噬體[13]。自噬體是細(xì)胞程序性死亡中分解老化及損傷細(xì)胞的主體。本研究中通過OXLDL 處理HUVEC 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著OX-LDL 劑量的增加，細(xì)胞自噬水平逐漸上升，陽性細(xì)胞比例逐漸增加，表明OX-LDL 可通過影響體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活細(xì)胞自噬，產(chǎn)生自噬小體。本研究中選擇以100 mg/L OXLDL 處理過的細(xì)胞，通過不同質(zhì)量濃度丹參酮ⅡA作用后發(fā)現(xiàn)，隨著丹參酮ⅡA劑量的增加，細(xì)胞中LC3 自噬小體減少，細(xì)胞自噬水平逐漸下降，陽性細(xì)胞比例逐漸降低，表明丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞自噬水平有抑制作用，可減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。

綜上所述，體內(nèi)OX-LDL 含量的增加對(duì)血管內(nèi)皮具有損傷作用，丹參酮ⅡA可通過降低體內(nèi)MDA 含量，增加SOD 活力，從而提高HUVEC 細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷能力，并降低細(xì)胞自噬水平，具有保護(hù)血管的作用。但本研究還缺乏對(duì)丹參酮ⅡA血管保護(hù)作用機(jī)制的研究，有待進(jìn)一步深入探討。