徐亞平，劉岳勇，李 浩，雙 峰，楊淮河

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇八醫(yī)院骨科脊柱病區(qū)，江西 南昌 330000）

骨折為常見(jiàn)的骨科疾病之一，雖然化學(xué)藥物[如甲狀旁腺素（PTH 1-34）、降鈣素等]在治療骨折方面取得了一定的成效，但由于有一定的毒副作用（如PTH 1-34會(huì)增加大鼠發(fā)生骨肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)），不合適長(zhǎng)期使用[1-2]。中醫(yī)藥治療骨折毒副作用小、療效好，適合骨折患者長(zhǎng)期使用。肉蓯蓉是一種寄生在沙漠樹(shù)木梭梭根部的寄生植物，麥角甾苷為其主要活性成分[3]。根據(jù)中醫(yī)“腎藏精，主骨，生髓”的理論，肉蓯蓉具有促進(jìn)骨愈合、防治骨科疾病的功效，但其在骨科疾病方面的應(yīng)用研究較少[4]。成骨細(xì)胞功能在調(diào)節(jié)骨代謝中有重要作用，其功能缺乏可能導(dǎo)致骨形成的負(fù)面影響，延緩骨折愈合的進(jìn)程[5]。BMP-2 蛋白在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成熟方面具有重要作用，可通過(guò)調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP） /Runx2 通路促進(jìn)骨折愈合[6]。本研究中探討了麥角甾苷通過(guò)調(diào)控BMP/Runx2 通路促進(jìn)骨折愈合，為其臨床應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥與儀器

SD 大鼠（中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)SCXK ＜京＞2014-0013）。麥角甾苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為190217）；復(fù)方骨肽注射液（江西康緣桔都藥業(yè)有限公司，批號(hào)為19012503）；10%水合氯醛（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，批號(hào)為190106）。堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；骨Gla 蛋白（BGP）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；TRIzol（天根生化科技有限公司）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（大連TaKaRa 公司）。BMP，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體瘤基因（BMPRIB），骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPR）Ⅱ，Runx2 和β-actin PCR 引物序列（上海生工生物工程有限公司）：BMP 上 游 引 物5′-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3′，下 游 引 物5′-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3′ ；BMPRIB 上游引物5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′，下 游 引 物5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′；BMPRⅡ上游引物5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′，下游引物5′-GAGGAGCCT GTGGAGAAA TAC-3′；Runx2 上游引物5′-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3′，下 游 引 物5′-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3′ ；β-actin 上 游 引 物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-GCATTTGCGGTGGACGA-3′。INSTRON3382 型生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)（美國(guó)英斯特朗公司）；AU5800 型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司）；HBS-1096B 型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo 公司）；BIO-RADCFX96 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 動(dòng)物分組及造模

選取雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量180 ～220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為對(duì)照組（A 組）、模型組（B 組）、陽(yáng)性組（C組）和麥角甾苷低、中、高劑量組（D1，D2，D3組）。用10%水合氯醛麻醉大鼠，切開(kāi)右側(cè)膝關(guān)節(jié)下皮膚，顯露脛骨。B 組、C 組和麥角甾苷組大鼠在膝關(guān)節(jié)下約1 cm 處用金屬鋸子鋸斷脛骨，進(jìn)行骨折斷端復(fù)位，用1.0 mm 克氏針進(jìn)行髓內(nèi)固定，用生理鹽水清洗傷口，逐層關(guān)閉傷口，A 組只暴露脛骨不鋸斷。術(shù)后連續(xù)3 d 肌肉注射8萬(wàn)U 青霉素預(yù)防感染，待大鼠蘇醒后回籠。大鼠蘇醒后，C 組腹腔注射復(fù)方骨肽（5 mg/kg），D1，D2，D3組分別腹腔注射麥角甾苷（20，40，80 mg/kg），A 組和B 組腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后4 周、8 周從各組大鼠中隨機(jī)取6 只，進(jìn)行麻醉后腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩７蛛x右側(cè)脛骨，進(jìn)行X 線攝片及骨生物力學(xué)檢測(cè)，分離骨痂組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

X 線攝片和骨生物力學(xué)：采用X 線攝像儀照相，觀察大鼠脛骨骨折愈合情況；采用生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)對(duì)股骨進(jìn)行最大荷載（骨折應(yīng)力）測(cè)試和骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度測(cè)試（骨壓碎力）的骨生物力學(xué)測(cè)量。

血清中ALP 和BGP 含量：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALP 的含量，采用ELISA 法試劑盒檢測(cè)血清中BGP 含量，操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

骨痂組織中BMP，BMPRIB，BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表達(dá)水平：取凍存的骨痂組織，加入1 mL TRIzol 后進(jìn)行總RNA 提取，根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，再根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明，制備20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃30 s 預(yù)變性、95 ℃5 s 變性、60 ℃44 s，40 個(gè)循環(huán)，61 ℃時(shí)采集熒光，以β-actin 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算。

圖1 各組大鼠骨折愈合情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X 線攝片結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖1。給藥4 周后，C 組和D2組、D3組大鼠骨折線完全消失，骨痂減少，但髓腔未通；B 組和D1組骨折線模糊，外骨痂存在。給藥8 周后，C 組和麥角甾苷各劑量組完全愈合、髓腔再通，B 組骨折線消失，骨痂減少，但髓腔未通。

2.2 骨折應(yīng)力和骨折碎力

結(jié)果見(jiàn)表1。給藥4 周后，與A 組相比，其余各組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力均明顯下降（P ＜0.05）；與B 組相比，C 組和麥角甾苷各劑量組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力均明顯上升（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性。給藥8 周后，與A 組相比，B 組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力均明顯上升（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性，C 組和麥角甾苷各劑量組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力恢復(fù)至正常。

表1 各組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力的比較（±s，kg）

表1 各組大鼠骨折應(yīng)力和骨折碎力的比較（±s，kg）

注：與A 組比較，a P ＜0.05；與B 組比較，b P ＜0.05；與C 組比較，c P ＜0.05；與D1 組比 較，d P ＜0.05；與D2 組比較，e P ＜0.05。下表同。

骨折應(yīng)力 骨折碎力A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組4 周12.04±3.79 4.61±1.25a 7.06±1.41ab 5.04±0.46abc 5.73±0.70abcd 6.89±1.05abde 8 周13.42±3.26 8.78±1.05a 12.68±2.31 9.66±0.915abc 10.82±1.35bcd 12.73±3.675abde 4 周10.38±2.21 7.35±1.67a 9.94±1.78ab 7.80±0.615abc 8.77±0.12bcd 9.56±1.90ab 8 周11.16±2.90 9.42±2.55a 10.86±1.68b 9.82±0.36bc 10.31±0.91bcd 10.82±3.425bde組別

表2 各組血清ALP 和BGP 含量比較（±s）

表2 各組血清ALP 和BGP 含量比較（±s）

A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組4 周149.09±12.50 170.26±20.13a 312.64±19.41ab 203.73±31.73abc 251.90±18.56abcd 315.47±18.46abde 8 周133.72±9.68 149.86±15.05a 163.71±22.42a 154.78±10.72abc 153.16±16.52abcd 162.83±12.84abde 4 周4.49±0.97 8.64±1.68a 15.20±3.42ab 9.28±1.04abc 13.41±2.68abcd 15.64±1.90abde 8 周4.85±0.90 5.93±0.67ab 11.02±0.99ab 6.82±0.39abc 8.25±1.53abcd 11.45±1.30abde ALP（U/L） BGP（ng/mL）組別

2.3 血清ALP 和BGP 含量

結(jié)果見(jiàn)表2。給藥4 周后，與A 組相比，其余各組大鼠血清ALP 和BGP 含量均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組相比，C 組和麥角甾苷各劑量組血清ALP 和BGP 含量均明顯上升（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性。給藥8 周后，B 組、C 組和麥角甾苷各劑量組大鼠血清ALP 和BGP 含量均明顯下降（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性，但C 組和麥角甾苷各劑量組血清ALP 和BGP 含量仍高于B 組（P ＜0.05）。

2.4 骨痂組織BMP 和BMPRIB mRNA 表達(dá)水平

結(jié)果見(jiàn)表3。給藥4 周后，與A 組相比，其余各組大鼠骨痂組織BMP 和BMPRIB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組相比，C 組和麥角甾苷各劑量組骨痂組織BMP 和BMPRIB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯上升（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性。給藥8 周后，B 組、C 組和麥角甾苷各劑量組大鼠骨痂組織BMP 和BMPRIB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性，但C 組和麥角甾苷各劑量組骨痂組織BMP 和BMPRIB mRNA 相對(duì)表達(dá)水平仍高于B 組（P ＜0.05）。

表3 各組骨痂組織BMP 和BMPRIBmRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組骨痂組織BMP 和BMPRIBmRNA 表達(dá)水平比較（±s）

A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組4 周1.00±0.08 1.48±0.11ab 2.77±0.36ab 1.95±0.32abc 2.27±0.19abcd 2.82±0.28abde 8 周0.98±0.12 1.22±0.09a 1.71±0.14ab 1.39±0.14abc 1.50±0.10abcd 1.86±0.09abde 4 周1.01±0.09 2.04±0.19abc 3.05±0.61ab 2.39±0.24abc 2.61±0.39abcd 2.97±0.56abde 8 周1.00±0.06 1.53±0.37ab 2.13±0.29ab 1.68±0.12abc 1.85±0.20abcd 2.25±0.30abde組別BMP BMPRIB

2.5 骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表達(dá)水平

結(jié)果見(jiàn)表4。給藥4 周后，與A 組相比，其余各組大鼠骨痂組織BMPRⅡ和Runx2mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高（P ＜0.05）；與B 組相比，C 組和麥角甾苷各劑量組骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水

平均明顯上升（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑

量依賴性。給藥8 周后，B 組、C 組和麥角甾苷各劑量組大鼠骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降（P ＜0.05），麥角甾苷各劑量組反應(yīng)呈劑量依賴性，但C 組和麥角甾苷各劑量組骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平仍高于B 組（P ＜0.05）。

表4 各組骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組骨痂組織BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組4 周1.00±0.05 2.34±0.56a 3.92±0.89ab 2.74±0.35abc 3.08±0.41abcd 3.98±0.91abde 8 周1.04±0.09 1.54±0.25a 2.26±0.41ab 1.69±0.52abc 1.87±0.12abcd 2.28±0.39abde 4 周0.99±0.010 2.13±0.56a 4.02±0.20aab 2.52±0.36abc 3.10±0.52abcd 3.94±0.29abde 8 周1.00±0.04 1.40±0.27a 2.23±0.49ab 1.68±0.26abc 1.97±0.14abcd 2.24±0.15abde BMPRⅡ Runx2組別

3 討論

肉蓯蓉為補(bǔ)腎壯陽(yáng)的傳統(tǒng)中草藥，麥角甾苷為其主要活性成分，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨愈合，防止骨質(zhì)疏松等功效[7]。本研究結(jié)果表明，麥角甾苷可促進(jìn)骨折大鼠骨痂形成，改善骨折大鼠愈傷組織的形成，這可能與其通過(guò)BMP/Runx2 信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的募集有關(guān)。復(fù)方骨肽注射液是臨床常用治療骨折的藥物，通過(guò)與復(fù)方骨肽注射液治療效果的比較，也進(jìn)一步證實(shí)了麥角甾苷能促進(jìn)骨折愈合[8]。

ALP 和BGP 在骨形成中起重要作用，ALP 為骨形成過(guò)程中的催化劑，從而促進(jìn)類骨質(zhì)形成和骨礦化；BGP可維持正常的骨礦化，抑制羥基磷灰石晶體的異常形成和軟骨礦化的影響[9-10]。本研究結(jié)果顯示，麥角甾苷治療可增加血清ALP 和BGP 水平，但在第8 周時(shí)ALP 逐漸恢復(fù)至正常水平，而B(niǎo)GP 仍處于較高水平?？赡芘cALP 是由未成熟的成骨細(xì)胞分泌，主要存在于骨折愈合的早期階段，而B(niǎo)GP 是由成熟的成骨細(xì)胞產(chǎn)生的，主要存在于骨折愈合的后期階段[11-12]。本研究結(jié)果表明，麥角甾苷可促進(jìn)血清骨形成因子分泌，促進(jìn)骨形成。

多條信號(hào)通路（如BMP，Smad 和Runx2 通路）積極參與控制骨形成[13]。BMP 是骨形成的重要蛋白質(zhì)，能刺激成骨細(xì)胞分化和骨形成，因?yàn)樗娜笔?huì)誘發(fā)自發(fā)性骨折[14]。BMP/Smad 信號(hào)由IB 型和Ⅱ型BMP 受體（即BMPRIB 和BMPRⅡ）及其下游分子Smad1、5 和8 介導(dǎo)，磷酸化的Smad1、5 和8 蛋白與Smad4 形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如Runx2，這是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，BMP的下游靶點(diǎn)[15-16]。Runx2 蛋白為主轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于成骨細(xì)胞分化的BMP 信號(hào)傳導(dǎo)的執(zhí)行和完成至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果證實(shí)，麥角甾苷可促進(jìn)骨痂組織中BMP，BMPRIB，BMPRⅡ和Runx2 mRNA 的表達(dá)，提示BMP/Runx2 信號(hào)通路參與了麥角甾苷誘導(dǎo)的骨折愈合。但本研究未測(cè)量Smad1、5 和8 蛋白磷酸化水平，同時(shí)如MAPK 信號(hào)通路在控制細(xì)胞增殖和分化中協(xié)同或獨(dú)立地發(fā)揮重要作用，p38 MAPK 信號(hào)通路可以積極地調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化，將在后續(xù)研究進(jìn)行探索和完善[18]。

綜上所述，麥角甾苷可促進(jìn)骨折大鼠的骨折愈合，作用機(jī)制可能與激活BMP/Runx2 信號(hào)通路有關(guān)。