劉曉云, 劉燕, 祖慶學, 廖恒, 馮裕洋, 祖萬斌,李碧寬, 陸引罡*

(1.貴州大學農(nóng)學院, 貴陽 550025; 2.貴州磷化集團貴州開磷質(zhì)量檢測中心, 貴州 開陽 550302;3.貴陽市煙草公司開陽分公司, 貴州 開陽 5503002)

煙草是多腺毛植物，其腺毛數(shù)量約占總表皮毛的85%[1]。煙株腺毛在生長發(fā)育過程中可分泌一種膠狀液體，這種膠狀液體被稱之為腺毛分泌物。研究表明，煙草表面腺毛分泌物占鮮葉質(zhì)量的0.5%～10%[2]，腺毛分泌物的數(shù)量由腺毛密度和單根腺毛分泌量決定，而腺毛的分泌物主要包括賴百當類和類西柏烷類兩類萜化合物[3-4]。這些物質(zhì)對煙葉的香氣、香味以及煙草的抗蟲性具有重要的作用[5-7]。類西柏烷類化合物的主要成分是西柏三烯二醇(包括α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇)，經(jīng)過調(diào)制后大部分降解，降解代表性產(chǎn)物有茄酮、茄尼呋喃、降茄二酮，其中茄酮在煙葉中存在數(shù)量較大，這些物質(zhì)既有煙草的重要致香成分，也包括煙葉重要的香氣前體物質(zhì)，與煙葉的香味品質(zhì)密切相關(guān)[8]。另外，煙葉中的石油醚浸提物和煙葉香氣也有很大關(guān)系，研究表明，石油醚浸提物含量與香氣量呈正相關(guān)[9-11]。因此石油醚浸提物與腺毛分泌物在一定程度上可以衡量煙葉品質(zhì)的好壞[7-9]。

煙葉中有機酸及高級脂肪酸對煙葉香氣質(zhì)也有一定的影響。煙草中含有大量有機酸，可分為揮發(fā)酸、半揮發(fā)酸和非揮發(fā)酸，占煙葉干物質(zhì)總量的 12%～16%，占煙葉鮮重的 2.1%～2.4%[12]。非揮發(fā)性有機酸包括蘋果酸、檸檬酸等，占煙草重量的5%～10%[13]；在煙株體內(nèi)部分與生物堿結(jié)合，部分以游離態(tài)存在[12]；其不僅可以調(diào)節(jié)煙株體內(nèi)pH，也可以使吃味變得醇和、增加煙氣濃度，從而影響烤煙香氣[14]。而高級脂肪酸可賦予煙葉特殊的香氣，對煙葉的品質(zhì)等有重要的影響[15-16]，如油酸、亞油酸等高級脂肪酸會增加煙氣的刺激性產(chǎn)生澀味。

現(xiàn)有研究表明，同一品種烤煙在不同光照[17]、水分[18]、海拔[19]等條件下，烤煙的腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物及有機酸含量存在一定的差異；同一條件下不同品種烤煙之間也存在一定的差異[20-22]。目前在同一生態(tài)環(huán)境和栽培條件下，不同烤煙品種腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物、非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸含量變化方面的研究較少。因此，本研究對同一生態(tài)環(huán)境和栽培條件下的貴州煙區(qū)主栽煙草品種的腺毛密度、腺毛分泌物、石油醚浸提物、非揮發(fā)性有機酸及高級脂肪酸進行檢測，分析不同品種間的差異，探究貴州主栽煙草品種腺毛及其腺毛分泌物的代謝特點，分析腺毛及其腺毛分泌物與部分有機酸、高級脂肪酸之間的相關(guān)性，為貴州煙區(qū)適宜栽種品種及已有主栽品種的優(yōu)劣評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為K326、紅花大金元、云煙87和云煙97，均由貴州省煙草公司遵義市公司提供。盆栽試驗土壤為黃壤土，基礎(chǔ)理化性狀為：全氮1.39 g·kg-1，堿解氮78.73 g·kg-1，有效磷33.13 g·kg-1，速效鉀139.33 g·kg-1，有機質(zhì)26.20 g·kg-1，pH 5.54。

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗地點為貴州大學南校區(qū)盆栽場。以K326(P1)、紅花大金元(P2)、云煙87(P3)、云煙97(P4)4個品種為影響因子，設(shè)計單因素盆栽試驗，采取隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次，分為3個時期取樣，共36盆。移栽前1 d每盆施煙草專用基肥(N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25)136.6 g，選取健壯、整齊煙苗進行移栽，每盆1株，移栽35 d后再施入煙草專用追肥(N∶P2O5∶K2O=13∶10∶26)41 g，每2～3 d澆水1次(約1 500 mL)。

1.3 樣品采集

試驗分別對烤煙團棵期、旺長期、成熟期的煙葉進行取樣，其中團棵期取整株烤煙葉片，旺長期與成熟期取煙株的第8～16片煙葉，將樣品在105 ℃下殺青0.5 h，65 ℃烘干，經(jīng)磨碎后過1 mm篩，備用。

1.4 測定項目及方法

1.4.1煙草腺毛密度統(tǒng)計 參照蔡璘等[23]方法進行煙草腺毛形態(tài)及密度檢測。避開葉片主側(cè)脈區(qū)域，從上部葉、中部葉、下部葉葉片中部剪下1.5 cm×0.5 cm的長方形，立即放入裝有戊二醛的離心管中，4 ℃冷藏24 h，棄去戊二醛，加入磷酸緩沖液洗滌，用30%、50%、70%、90%、100%丁叔醇逐級脫水，4 ℃冷卻10 min，-40 ℃冷凍干燥30～40 min，將樣品貼于導(dǎo)電膠，鍍金膜，完成制片。用SE-3000電子顯微鏡(日立公司)掃描拍照后，人工計數(shù)長柄腺毛和短柄腺毛的數(shù)量。

1.4.2石油醚提取物含量測定 參照閆克玉等[24]方法測定煙草中石油醚提取物含量。將烘干粉碎的樣品稱重記為a，105 ℃烘干3 h，稱重并記錄重量為b。放入浸提筒，倒入石油醚至接受瓶三分之二處，75 ℃水浴8 h提取。將紙袋取出，在通風處使乙醚揮發(fā)。將樣品放入烘箱105 ℃烘干2 h，于干燥器中冷卻后稱重記為c。

石油醚干基=[(b-c)/(b-a)]×100%

1.4.3西柏三烯二醇含量測定 參照趙華新等[25]方法測定西柏三烯二醇含量。具體如下：稱取0.4 g煙末于40 mL色譜瓶中，加入0.5 mL內(nèi)標及10 mL乙腈，超聲萃取10 min，加無水硫酸鈉。待溶液澄清后，吸1 mL上清液到1.5 mL色譜瓶中，用氮吹儀將溶液吹干后加入0.25 mL DNF和0.25 mL BSTFA，在75 ℃水浴中衍生化反應(yīng)60 min，取出待測。GC-14B氣相色譜儀，PEG-20M彈性石英毛細管柱(25 m×0. 25 mm id×0.25 μm df),載氣柱頭壓140 kPa。進樣口溫度250 ℃程序升溫，40 ℃保持2 min，然后以6 ℃·min-1升溫至 180 ℃ 保持 2 min，以2 ℃·min-1升溫至 280 ℃ 保持 20 min；載氣為高純氦氣，載氣流速為恒流 0.8 mL·min-1；進樣量 1.0 μL，分流比15∶1；MS 條件為傳輸線溫度 250 ℃，EI 離子源溫度280 ℃ ，電離能量70 eV，質(zhì) 量 數(shù) 范 圍50～650 amu；檢索譜庫NIST 11。

1.4.4烤煙有機酸和高級脂肪酸的測定 參照劉百戰(zhàn)等[26]方法測定有機酸及高級脂肪酸含量。具體如下：稱取0.5 g煙末于干燥三角瓶中,加入25 mL硫酸—甲醇溶液與0.1 mL內(nèi)標溶液(己二酸-甲醇溶液)搖勻，放置20 h后過濾到裝有50 mL蒸餾水的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3次后，加無水硫酸鈉干燥，取1.0 μL進行測定。有機酸和脂肪酸標樣的制定過程相同，GC-14B氣相色譜儀，PEG-20M彈性石英毛細管柱(25 m×0.25 mm id×0.25 μm df),載氣柱頭壓140 kPa。不分流進樣,不分流時間為1 min,分流比1∶50。檢測器FID,氫氣流量40 mL·min-1,空氣流量500 mL·min-1,尾吹氣流量30 mL·min-1。二階程序升溫,初溫60 ℃,保持2 min, 12 ℃·min-1升到120 ℃,再以6 ℃·min-1升到200 ℃,保持5 min，汽化室和檢測器溫度為250 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2003進行數(shù)據(jù)整理，用DPS 7.05進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同品種烤煙腺毛密度分析

腺毛按其形態(tài)可分為長柄腺毛和短柄腺毛。一般認為，腺毛密度大、發(fā)育良好、腺毛分泌物多的烤煙吃味醇和、香氣濃郁[27]。由圖1可知，各品種烤煙長柄、短柄、總腺毛密度在旺長期最大，隨后整體下降，旺長期到成熟期4個品種P1、P2、P3、P4總腺毛密度分別下降9%、12%、6%、11%。說明烤煙腺毛密度到旺長期之后，隨著煙葉的成熟腺毛逐漸脫落，云煙87腺毛脫落率較低。

各生長時期烤煙長、短柄腺毛密度存在一定差異。團棵期，P2品種的長柄腺毛密度較P1高7%，P4較P1低8%；旺長期，P2品種的長柄腺毛密度較P1高4%， P3、P4較P1低4%、4%， P3和P4無顯著差異；成熟期，P2的長柄腺毛密度較P1高3%，P4較P1低6%。團棵期，P2、P3品種的短柄腺毛密度較P1分別高9%和12%，P4較P1低7%，P2與P3無顯著差異；旺長期，P2品種的短柄腺毛密度較P1高7%， P4較P1低16%；成熟期，P2的短柄腺毛密度較P1高5%，P4較P1低9%。綜上，長柄腺毛和總腺毛密度整體均表現(xiàn)為紅花大金元>K326>云煙87>云煙97。

注：不同英文字母表示同一時期同一指標不同品種間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義，不同希臘字母表示同一指標同一品種在不同生長時期間差異P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.圖1 不同品種烤煙腺毛密度Fig.1 Glandular hair density of different varieties of flue-cured tobacco

2.2 不同品種烤煙西柏三烯二醇含量

西柏三烯二醇是煙草腺毛最主要的分泌物，一般認為，西柏三烯二醇含量越高，煙葉香氣越醇[28]。由圖2可知，α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、(α+β)-西柏三烯二醇含量在旺長期最高，隨后呈下降趨勢。隨著煙葉的發(fā)育，烤煙α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇和(α+β)-西柏三烯二醇含量在各品種間存在一定差異。團棵期，品種P2、P3、P4的α-西柏三烯二醇含量較P1分別高24%、22%和9%；旺長期，P2、P3的α-西柏三烯二醇含量分別較P1高9%和36%，較P4低7%。團棵期，P2、P3的β-西柏三烯二醇含量分別較P1 高10%和25%；旺長期，P2、P3的β-西柏三烯二醇含量分別較P1高13%、33%，較P4低11%。團棵期，P2、P3、P4的 (α+β)-西柏三烯二醇含量分別較P1高19%、23%和6%；旺長期，P2、P3的 (α+β)-西柏三烯二醇含量分別較P1高11%和35%，較P4低8%。在旺長期以前，隨著生育期的增加，各烤煙品種總西柏三烯二醇含量表現(xiàn)為云煙87>紅花大金元>K326>云煙97，說明云煙87分泌西柏三烯二醇能力較高。旺長期到成熟期P1、P2、P3、P4西柏三烯二醇含量分別下降36%、54%、69%和39%，說明西柏三烯二醇不穩(wěn)定，易降解為其他物質(zhì)，其降解強度表現(xiàn)為云煙87>紅花大金元>云煙97>K326。

2.3 不同品種烤煙石油醚提取物含量分析

煙葉石油醚提取物含量常作為評價煙草香味的重要指標之一[29]，煙葉石油醚提取物含量高，品質(zhì)也相對較高。由圖3可知，隨著煙株的生長，煙葉石油醚浸提物含量呈逐漸增加趨勢。團棵期，品種P2的煙葉石油醚浸提物含量較P1高12%，P3的煙葉石油醚浸提物含量較P1低7%；旺長期，P2的煙葉石油醚浸提物含量較P1高9%，較P4低14%；成熟期，P2的煙葉石油醚浸提物含量較P1高14%，P4低9%。綜上，各品種的煙葉石油醚浸提物含量，隨著生育期的增加而增加，其中紅花大金元顯著高于其他3個品種；K326和云煙87兩個品種的石油醚提取物含量無顯著差異，云煙97石油醚提取物含量最低。

注：不同英文字母表示同一時期同一指標不同品種間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義，不同希臘字母表示同一指標同一品種在不同生長時期間差異P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.圖2 不同品種烤煙西柏三烯二醇含量Fig.2 Content of cyprotriene glycol in different varieties of flue-cured tobacco

注：不同英文字母表示同一時期不同品種間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義，不同希臘字母表示同一品種在不同生長時期間差異P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different English letters of the same growth stages indicate statistically significant difference between different varieties in at P<0.05 level. Different Greek letters of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.圖3 不同品種烤煙各時期石油醚浸提物含量Fig.3 Contents of petroleum ether extracts of different growth stages from different varieties of flue-cured tobacco

2.4 不同品種烤煙部分有機酸及高級脂肪酸含量分析

蘋果酸可以增加煙氣酸性、改進煙氣、使煙氣平和，其含量和煙葉的品質(zhì)呈正相關(guān)；檸檬酸的含量則和煙葉品質(zhì)呈負相關(guān)[14]。不同品種烤煙部分有機酸含量結(jié)果(圖4) 可知，P1、P2、P3、P4的蘋果酸、檸檬酸在不同生長時期均存在一定差異。團棵期，P2品種的檸檬酸含量較P1高28%，P3的蘋果酸、檸檬酸含量分別較P1高14%、22%，P4的蘋果酸含量較P1低13%，而檸檬酸含量較P1高17%；旺長期，P2的蘋果酸含量較P1低24%，P4的檸檬酸含量較P1高40%，蘋果酸含量低10%；成熟期，P2、P3的檸檬酸含量分別較P1高32%、24%，P4的檸檬酸含量較P1高53%，蘋果酸含量較P1低29%。綜上，隨著生育期的增加，各品種蘋果酸含量云煙87相對較高，檸檬酸含量表現(xiàn)為云煙97最高，K326最低，紅花大金元和云煙87中等。

不同品種烤煙部分高級脂肪酸含量結(jié)果(圖4)可知，P1、P2、P3、P4的油酸、亞油酸含量在不同時期存在一定差異。團棵期，P2、P3品種的亞油酸含量分別較P1高25%、28%，P4的油酸含量較P1低15%，亞油酸含量較P1高31%；旺長期，P2的油酸、亞油酸含量分別較P1高57%、85%，P3的油酸、亞油酸含量分別較P1高57%、85%，P4的油酸、亞油酸含量分別較P1高50%、81%；成熟期，P3的油酸、亞油酸含量分別較P1高54%、62%，P4的油酸、亞油酸含量分別較P1高55%、73%。綜上，隨著生育期的增加，各品種中，云煙87的油酸、亞油酸含量相對較高。

注：不同英文字母表示同一時期同一指標不同品種間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義，不同希臘字母表示同一指標同一品種在不同生長時期間差異P<0.05水平具有統(tǒng)計學意義。Note: Different English letters of the same index indicate statistically significant difference between different varieties in the same period at P<0.05 level. Different Greek letters of the same index of the same variety indicate statistically significant difference between different growth stages at P<0.05 level.圖4 不同品種烤煙各時期部分有機酸和高級脂肪酸含量Fig.4 Contents of organic acid and higher fatty acid of different growth stages from different varieties of flue-cured tobacco

2.5 相關(guān)性分析

煙葉的品質(zhì)是各因子綜合表現(xiàn)的結(jié)果，分析各指標的相關(guān)性有利于優(yōu)良品種的選擇。 分別對各時期4個烤煙品種的各項指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果(表1)可知，團棵期，短柄腺毛與β-西柏三烯二醇、蘋果酸含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系(0.89和0.92)；α-西柏三烯二醇與檸檬酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(0.96)，β-西柏三烯二醇與蘋果酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(0.93)。旺長期，長、短柄腺毛與石油醚提取物含量呈顯著和極顯著正相關(guān)關(guān)系(0.91和1.00)，α-西柏三烯二醇與β-西柏三烯二醇呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(0.98)，油酸與亞油酸含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(1.00)。成熟期，長柄腺毛與石油醚提取物呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(0.96)，與亞油酸含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系(-0.90)；短柄腺毛與蘋果酸呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(0.99)，檸檬酸含量與短柄腺毛、蘋果酸呈顯著負相關(guān)關(guān)系(-0.98和-0.94)，油酸與亞油酸含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(0.99)。 可以看出，腺毛密度、有機酸、萜類物質(zhì)、石油醚浸提物、有機酸之間存在密切的關(guān)系，其必然存在一定的影響機制。一個品種的優(yōu)異并不代表它所有的品質(zhì)化學成分含量都是最優(yōu)，在實踐中需要結(jié)合工業(yè)可用性、感官品吸、產(chǎn)量、抗病性、特定品種需要來進行選擇。

表1 不同烤煙品種各時期各項指標相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of various indexes of different flue-cured tobacco varieties at each stage

3 討論

烤煙是多腺毛植物，薛曉明等[30]研究黑龍江10個烤煙品種時發(fā)現(xiàn)，腺毛密度受環(huán)境因素影響較大，烤煙品種的選育可把腺毛密度作為參考指標。蔡璘等[23]也證實了這一觀點。本研究表明，腺毛密度隨著生育期的增加呈先增加后降低趨勢；長柄腺毛、總腺毛密度整體表現(xiàn)為紅花大金元>K326>云煙87>云煙97，成熟期云煙87腺毛脫落率最低，這與張亞婕等[27]、李鵬飛等[31]、查宏波等[32]的研究結(jié)論相似。而劉曉云等[33]研究發(fā)現(xiàn)K326的腺毛密度較紅花大金元更高， 原因可能是栽植過程中的不同肥力條件造成?？緹熀笃谏L肥力供應(yīng)不足影響烤煙腺毛發(fā)育的機理，有待進一步研究。

西柏三烯二醇不僅是煙草腺毛最主要的分泌物，還是烤煙香味的前體物質(zhì)，其含量越高，煙葉香氣越醇[28]。王冬等[34]與Zhu等[35]研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)不同烤煙品種分泌西柏三烯二醇含量存在一定差異。本研究顯示，在試驗區(qū)氣候條件下，各品種烤煙西柏三烯二醇含量隨著時間的增加呈先增加后降低的趨勢，與劉翠翠[36]的研究結(jié)論相吻合，即不同烤煙品種隨著煙株的生長，西柏三烯二醇含量呈先升高后降低趨勢。成熟期西柏三烯二醇不穩(wěn)定，易降解，其降解強度表現(xiàn)為云煙87>紅花大金元>云煙97>K326，所以煙葉要適時采收，即使是西柏三烯二醇二醇含量較高的品種云煙87，也會因為過熟而導(dǎo)致西柏三烯二醇迅速降解，甚至低于其它品種。

石油醚提取物包含煙葉的脂肪酸酯、脂肪醇、揮發(fā)油、脂肪酸、蠟質(zhì)、類脂物、菌醇、色素等[37]，殷全玉等[38]發(fā)現(xiàn)不同品種烤煙石油醚提取物存在顯著差異。本研究表明，隨著煙株的生長，各品種烤煙煙葉石油醚浸提物含量逐漸增加，整體表現(xiàn)為紅花大金元最高，云煙97次之，K326和云煙87含量中等，這與王勇等[39]研究結(jié)果一致。從石油醚提取物與腺毛相關(guān)性來看，旺長期和成熟期的石油醚提取物均與長柄、短柄腺毛密度呈正相關(guān)，與張思琦等[40]研究結(jié)論一致。

煙草蘋果酸、檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，參與合成蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，成熟期煙葉蘋果酸含量與煙葉品質(zhì)呈正相關(guān)，能增加煙葉酸性，而檸檬酸與煙葉品質(zhì)呈負相關(guān)[29]。油酸、亞油酸在一定條件下會分解為己醛、己烯等物質(zhì)，這些物質(zhì)會增加煙葉刺激性及粗糙感，從而影響煙葉品質(zhì)[16,41]。因此，研究不同品種蘋果酸、檸檬酸、油酸及亞油酸水平，可以為煙草選育提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，從整體上看，云煙87的蘋果酸、油酸、亞油酸含量均較高，而檸檬酸含量隨著生育期的增加表現(xiàn)為云煙97最高，K326最低。

綜上，在同一生態(tài)及栽種條件下，K326、紅花大金元、云煙87、云煙97四個品種中，紅花大金元的腺毛密度與石油醚浸提物含量均較高；而云煙87的α-西柏三烯二醇、β-西柏三烯二醇、(α+β)-西柏三烯二醇、蘋果酸、油酸、亞油酸含量及腺毛脫落率等指標方面表現(xiàn)較優(yōu)。因此，在貴州地區(qū)推薦種植云煙87和紅花大金元，但仍需要結(jié)合其它因素進行考慮，如品種的抗性、產(chǎn)量等，這有待于進一步研究。