薛痕 龔仲琴 常曉東 趙敏 楊有芹 馬霞

625000 雅安，四川省雅安市人民醫(yī)院腎內(nèi)科

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)是成人原發(fā)性腎病綜合征常見的病理類型，在我國發(fā)病率呈逐年上升趨勢，一項(xiàng)大型多中心回顧性研究調(diào)查了2004～2014年我國71 151例腎穿刺病例，發(fā)現(xiàn)IMN所占比率為23.4%[1]。2009年Beck等[2]首次發(fā)現(xiàn)約70%的IMN患者腎小球中表達(dá)M型磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor，PLA2R)抗原?，F(xiàn)有的研究提示抗PLA2R抗體是診斷IMN敏感性及特異性較好的血清學(xué)標(biāo)志物。此外，研究發(fā)現(xiàn)在8%～14%的PLA2R抗體陰性的IMN患者可以檢測到另一種足細(xì)胞膜抗原——1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(thrombospondin type I domain containing 7A，THSD7A)[3]。但目前國內(nèi)關(guān)于IMN患者腎小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)亞型及補(bǔ)體分布情況的研究報(bào)道不多。聯(lián)合檢測血清PLA2R抗原及其抗體，以及聯(lián)合檢測腎小球PLA2R、THSD7A與IgG4在IMN中的臨床價(jià)值也有待深入研究。本研究通過檢測IMN患者血清抗PLA2R抗體水平以及腎小球PLA2R、THSD7A和IgG亞型的表達(dá)，評價(jià)它們對于IMN鑒別診斷的價(jià)值。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2019年6月在雅安市人民醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎臟病理活檢確診為腎小球病變并且資料完整的144例患者作為研究對象，按所患疾病分為IMN組72例和非IMN組72例。其中IMN組包括男性48例，女性24例，年齡(55.5±12.0)歲，Ⅰ期IMN 12例，Ⅰ～Ⅱ期IMN 4例，Ⅱ期IMN 52例，Ⅲ期IMN 4例；非IMN組包括男40例，女32例，年齡(45.2±13.0)歲，包括微小病變性腎病8例、IgA腎病32例、輕度系膜增生性腎小球腎炎6例、狼瘡腎炎8例(Ⅳ+Ⅴ狼瘡腎炎3例)、局灶節(jié)段性腎小球硬化10例、紫癜性腎炎8例。IMN的診斷是依據(jù)腎穿刺病理活檢結(jié)果，并排除乙肝病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤、藥物或毒物等繼發(fā)因素所致的繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。本研究選取的所有病例腎穿刺前均未經(jīng)激素、免疫抑制劑治療。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求，并經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。所有入選患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.臨床資料收集 收集入選患者的性別、年齡、24 h尿蛋白定量(24 h urine protein quantity，24hUPro)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)等相關(guān)臨床資料。

2.血清PLA2R抗體檢測 采用德國歐蒙公司抗PLA2R抗體IgG檢測試劑盒檢測患者血清PLA2R抗體滴度(ELISA法)，測定值≥20 RU/mL為陽性。檢測由成都華銀醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司完成。

3.腎組織病理觀察 采用實(shí)時B超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎臟穿刺術(shù)采集腎組織樣本，染色后在光鏡、熒光顯微鏡、電鏡下觀察。

4.腎組織PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及補(bǔ)體檢測 使用Sigma公司鼠抗人PLA2R1、THSD7A抗體檢測腎組織PLA2R及THSD7A(間接免疫熒光法)，使用Sigma公司鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗體檢測腎小球IgG亞型(直接免疫熒光法)。腎組織PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及補(bǔ)體的免疫熒光染色強(qiáng)度評估采用0～+++(0為陰性，+為弱陽性，++為中陽性，+++為強(qiáng)陽性)進(jìn)行半定量評分。檢測由沈陽迪安病理診斷中心完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清抗PLA2R抗體與IMN的關(guān)系

1.兩組患者臨床資料比較 IMN組血清抗PLA2R抗體滴度、抗PLA2R抗體陽性率以及年齡明顯高于非IMN組(P<0.01)，非IMN組Scr高于IMN組(P<0.05)，兩組性別、血清Alb、BUN、24hUPro比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表1)

表1 IMN組與非IMN組臨床資料的比較

2.IMN組患者血清抗PLA2R抗體陽性者與陰性者臨床資料比較 血清抗PLA2R抗體陽性者24hUPro明顯高于陰性者(P<0.01)，血清Alb低于陰性者(P<0.05)。而兩者年齡、性別、血清BUN、Scr比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表2)

表2 IMN組PLA2R抗體陽性者與陰性者臨床資料的比較

3.血清抗PLA2R抗體診斷IMN的價(jià)值 以腎活檢病理為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制血清PLA2R抗體診斷IMN的ROC曲線。結(jié)果顯示，抗PLA2R抗體診斷IMN的靈敏度為61.11%，特異度為97.22%，陽性似然比為21.98，陰性似然比為0.40，Youden指數(shù)為0.58，AUCRoc為0.845(95%CI0.750～0.940)。(圖1)

圖1 血清抗PLA2R抗體診斷IMN的ROC曲線

二、腎小球PLA2R、THSD7A、IgG與IMN的關(guān)系

1.兩組患者腎小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及補(bǔ)體表達(dá)比較 IMN組患者腎小球PLA2R陽性率為80.56%，平均熒光強(qiáng)度1.33±0.79；腎組織THSD7A陽性率為8.33%，平均熒光強(qiáng)度0.14±0.49。在IgG亞型中，IMN組患者以IgG4和IgG1沉積為主，IgG4陽性率為97.22%，IgG1陽性率為86.11%，兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.424，P=0.233)，但是IgG4免疫熒光強(qiáng)度明顯高于IgG1(t=4.202，P<0.01)。所有IMN患者腎組織免疫熒光可見C3沉積，均未見補(bǔ)體裂解產(chǎn)物C1沉積。IMN組與非IMN組腎小球免疫熒光檢測比較結(jié)果見表3、4。IMN腎小球IgG1、IgG4、PLA2R及THSD7A免疫熒光陽性圖見圖2。

圖2 IMN腎小球IgG1、IgG4、PLA2R、THSD7A免疫熒光陽性圖(IF，×200) A.IgG1；B.IgG4；C.PLA2R；D.THSD7A

表3 IMN組與非IMN組腎小球PLA2R、THSD7A、免疫球蛋白及補(bǔ)體免疫熒光強(qiáng)度比較

注：-表示未檢出

表4 IMN組與非IMN組腎小球免疫熒光表達(dá)陽性率比較[例(%)]

2.腎組織PLA2R、THSD7A及IgG4對IMN診斷的價(jià)值 腎組織PLA2R、THSD7A、IgG4診斷IMN的靈敏性分別為80.56%、8.33%、97.22%，特異性分別為100.00%、100.00%、97.22%，AUCRoc分別為0.903(95%CI0.823～0.982)、0.542(95%CI0.408～0.675)和0.972(95%CI0.944～1.000)。(表5)

表5 腎組織PLA2R、THSD7A及IgG4診斷試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)結(jié)果

3.腎小球PLA2R、THSD7A、IgG4聯(lián)合檢測的價(jià)值 腎組織PLA2R、THSD7A和IgG4中任一指標(biāo)陽性即診斷IMN的敏感性為97.22%。腎組織PLA2R、THSD7A中任一指標(biāo)陽性即診斷IMN的敏感性為86.11%。(表6)

表6 IMN組腎組織IgG4、 PLA2R和THSD7A聯(lián)合檢測結(jié)果(n=72)

注：+代表陽性，-代表陰性

4.PLA2R抗原及其抗體聯(lián)合檢測的價(jià)值 血清抗PLA2R抗體和腎組織PLA2R抗原任一指標(biāo)陽性即診斷IMN的敏感性為83.33%。(表7)

表7 IMN組患者PLA2R抗原與抗體聯(lián)合檢測結(jié)果[例(%)]

討 論

本研究結(jié)果顯示血清抗PLA2R抗體診斷IMN的靈敏度為61.11%，特異度為97.22%，診斷IMN的ROC曲線下面積為0.845。其他研究結(jié)果與本研究相符合，目前國外眾多學(xué)者報(bào)道抗PLA2R抗體診斷IMN的敏感性為52.1%～70.6%[4-7]，特異性為97%～100%[8-9]。血清抗PLA2R抗體檢測方便易行，對于臨床中有腎穿禁忌患者的IMN鑒別診斷具有重要價(jià)值。

除PLA2R抗體外，腎組織PLA2R抗原對IMN診斷也具有重要價(jià)值。Li等[9]的一篇共納入了16項(xiàng)研究的Meta分析顯示，腎組織PLA2R抗原對IMN診斷的敏感性、特異性分別為79%(76%～81%)、90%(88%～92%)。本研究顯示腎小球PLA2R診斷IMN的敏感性為80.56%，腎小球PLA2R診斷的敏感性較血清抗PLA2R抗體高，而聯(lián)合腎小球PLA2R抗原和血清抗PLA2R抗體檢測，則診斷的敏感性提高為83.33%，提示聯(lián)合PLA2R抗原抗體檢測是診斷IMN更加敏感和可靠的方法。此外，本研究發(fā)現(xiàn)22.22%的患者腎組織PLA2R抗原陽性而血清PLA2R抗體陰性，提示血清PLA2R抗體陰性患者不能排除PLA2R相關(guān)IMN。這種情況存在的原因可能為：(1)在IMN發(fā)病的早期，血清循環(huán)PLA2R抗體與腎小球PLA2R抗原結(jié)合尚未飽和，血清中抗體滴度很低甚至測不出；(2)血清抗PLA2R抗體陽性率與IMN疾病活動度相關(guān)，當(dāng)疾病緩解時血清循環(huán)抗PLA2R抗體被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而檢測不出，與血清抗PLA2R抗體相較而言，腎小球足細(xì)胞PLA2R抗原清除相對滯后；(3)檢驗(yàn)誤差。

IgG亞型在IMN診斷中的作用也一直受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示IMN患者IgG1與IgG4陽性率均較高，兩者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是IgG4免疫熒光強(qiáng)度明顯高于IgG1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hofstra等[10]用間接免疫熒光法測定IMN患者IgG亞型，發(fā)現(xiàn)IgG亞型在腎小球的分布比例分別為IgG1(56%)、IgG2(4%)、IgG3(53%)和IgG4(69%)，并且IgG4的免疫熒光強(qiáng)度而非IgG1與IMN患者自發(fā)緩解相關(guān)。Schroeder[11]的研究發(fā)現(xiàn)IgG1在所有IgG亞型中比例最高(67%)，而IgG4在所有IgG亞型中少見(4%)。IgG1在免疫應(yīng)答中普遍存在，故對IMN的診斷無特殊意義。管音等[12]的研究也指出IMN腎小球以IgG4沉積為主，IgG4強(qiáng)度高于IgG1和IgG3。IgG4陽性且C1q陰性，可以幫助鑒別IMN與膜性狼瘡腎炎。Huang等[13]在一項(xiàng)納入157例膜性腎病的研究中發(fā)現(xiàn)在膜性腎病早期(Ⅰ期)腎小球毛細(xì)血管沉積物以IgG1為主，在膜性腎病的中晚期(Ⅰ-Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ-Ⅲ期、Ⅲ-Ⅳ期)則以IgG4沉積為主。本研究納入的研究對象主要為Ⅱ期IMN患者，故腎小球IgG4陽性率和熒光強(qiáng)度均高。本研究顯示IgG4對于IMN診斷的敏感性為97.22%，特異性為97.22%，提示IgG4對IMN鑒別診斷有很高的價(jià)值。此外，本研究發(fā)現(xiàn)IMN患者腎組織無補(bǔ)體裂解產(chǎn)物C1q沉積，分析其原因可能與IgG4對靶抗原的親和力低有關(guān)，其獨(dú)特的Fab臂交換反應(yīng)(半抗體交換反應(yīng))決定了它不能結(jié)合補(bǔ)體Clq從而激活經(jīng)典途徑[14]。Larsen等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)IMN患者腎小球Clq沉積少見或者檢測不到，提示經(jīng)典途徑可能不是IMN補(bǔ)體激活的主要途徑。IMN發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體密切相關(guān)，但補(bǔ)體反應(yīng)是通過何種途徑激活還有待探索。

2014年Tomas[3]團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一類新的足細(xì)胞抗原，即THSD7A，提出THSD7A可能是除PLA2R之外參與IMN發(fā)病的第二靶抗原。目前國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腎小球THSD7A的陽性率約2%～9.1%(免疫組化法)[16-19]。本研究顯示IMN患者腎小球THSD7A的陽性率為8.33%(包括2例腎小球PLA2R與THSD7A雙陽性)，提示THSD7A陰性不能排除IMN的診斷。既往認(rèn)為THSD7A與PLA2R相對獨(dú)立，THSD7A僅存在于血清抗PLA2R抗體陰性的IMN患者。但近年來的報(bào)道打破了這一觀念，發(fā)現(xiàn)2例IMN患者血清PLA2R和THSD7A抗體雙陽性并且腎組織抗原雙陽性[17]。Wang等[19]的報(bào)道顯示THSD7A和PLA2R雙陽性IMN患者，兩種抗原共同定位于沉積的免疫復(fù)合物中，相互間無交叉反應(yīng)，兩者共同參與了免疫復(fù)合物的形成。目前尚不能確定這類患者是否與THSD7A相關(guān)IMN或PLA2R相關(guān)IMN類似，或者是一類完全不同的新類型。非常有意義的是本研究中也發(fā)現(xiàn)2例IMN患者腎小球PLA2R與THSD7A雙陽性，證實(shí)了IMN中PLA2R與THSD7A兩種靶抗原可以同時存在，但這類患者的臨床特征及發(fā)病機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。有研究提示THSD7A可能與腫瘤相關(guān)[19]，但本研究中2例患者已隨訪1.5年尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤。此外，本研究發(fā)現(xiàn)8例IMN患者腎小球IgG4陽性而THSD7A及PLA2R均為陰性，這種現(xiàn)象的解釋是除THSD7A及PLA2R外，IMN患者還存在其他致病性抗原，有研究報(bào)道IgG4同樣為其他致病抗原如超氧化物歧化酶、醛糖還原酶、α-烯醇酶產(chǎn)生的特異性自身抗體[20-21]。

綜上所述，血清抗PLA2R抗體、腎小球PLA2R、THSD7A及IgG4亞型對于IMN鑒別診斷具有較高的臨床價(jià)值；腎小球PLA2R抗原和血清抗PLA2R抗體的聯(lián)合檢測，腎小球PLA2R、THSD7A與IgG4的聯(lián)合檢測可以增加IMN診斷的敏感性。但本研究尚存在不足之處：(1)本研究為單中心研究、樣本量偏??；(2)因?yàn)镾MN患者樣本量少，本研究未單獨(dú)設(shè)立SMN組和探討SMN患者血清PLA2R抗體陽性率，以及腎組織PLA2R、THSD7A和IgG亞型的表達(dá)。有待后續(xù)開展更大樣本量的研究，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。