楊 煬，宋小仙，涂如霞，蘭 波，吳思瀾，

莫宗成，羅金萍，張 莉，劉劍毅＊＊

（重慶市中藥研究院 重慶 400065）

雷公藤次堿為雷公藤中常見生物堿，從雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook）.F.（TWHF）根和皮中提取出，是雷公藤根皮中主要生物活性物質(zhì)，含量較高，具有明顯的體液免疫和細胞免疫抑制作用，被廣泛用作治療廣譜自身免疫性和炎性疾病的中藥，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，強直性脊柱炎，牛皮癬和特發(fā)性IgA 腎病[1-2]，活性較強且毒性小于雷公藤甲素，越來越受關(guān)注[3]。經(jīng)雷公藤提取上市的雷公藤多苷片成功的應(yīng)用于臨床多年[4-5]，其治療特征可歸因于兩大類成分：萜類化合物和吡啶生物堿類化合物，萜類包括雷公藤內(nèi)酯，三萜化物和三萜內(nèi)酯，吡啶生物堿類包括雷公藤堿、雷公藤次堿、雷公藤春堿等。研究表明雷公藤次堿是雷公藤多苷片的代表性化合物之一[6]。迄今為止，報道了雷公藤甲素、紅素等藥代動力學(xué)[7-9]，但吡啶生物堿的藥代動力學(xué)信息仍然非常有限，因此有必要對雷公藤次堿進行體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。

目前，超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）是天然產(chǎn)物分析中最有效的分析技術(shù)之一[10]。UPLC 的分離度明顯優(yōu)于HPLC，其色譜峰擴展很小，峰濃度很高，有利于化合物的離子化，同時有利于與基質(zhì)雜質(zhì)的分離，降低基質(zhì)效應(yīng)，使靈敏度和重現(xiàn)性大大提高[11]。質(zhì)譜及質(zhì)譜聯(lián)用對目標(biāo)化合物進行不同的碎片掃描，可有效識別混合物中的目標(biāo)化合物，顯著提高信噪比[12]。UPLC-MS/MS 將色譜的高鑒別性能和質(zhì)譜的高分離特點完美結(jié)合，具有高分離能力，高靈敏度，應(yīng)用范圍廣和專屬性強等特點，符合現(xiàn)代藥物分析研究對高精密度和準(zhǔn)確度分析方法的需求[13]，廣泛運用于中藥復(fù)雜成分研究及環(huán)境分析、藥物分析等領(lǐng)域。本實驗以雷公藤中雷公藤次堿為研究對象，建立了UPLC-MS/MS 法檢測雷公藤次堿的犬血漿濃度，表征了雷公藤次堿的藥代動力學(xué)，明確了雷公藤次堿在犬體內(nèi)作用規(guī)律，對雷公藤次堿的臨床使用提供重要參考。

1 實驗材料

1.1 試藥與儀器

雷公藤次堿（北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司，純度≥98%；批號：L-053180122），雷公藤春堿（北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司，純度≥98%；批號：L-103-171216）；醋酸銨（ACS公司，批號：35Y1402KS）。

高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司，型號：API 4000）；超高效液相系統(tǒng)（日本島津公司，型號：LC-30AD）；十萬分之一精密電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，型號：XS105DU）；渦旋儀（英國Stuart 公司，型號：SA8）；離心機（美國Beckman Coulter 公司，型號：Microfuge 22R）；超純水凈化系統(tǒng)（美國密理博公司，型號：Elix10）。

1.2 實驗動物

Beagle 犬，普通級，雌性各半，體重7.0-9.0 kg，購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2017-0003，動物檢疫及適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。

2 實驗方法

2.1 對照品與供試品溶液的制備

分別精密稱量對照品雷公藤次堿和內(nèi)標(biāo)（雷公藤春堿）各10.25 mg、10.17 mg 于100 mL，加乙腈制成102.50 μg·mL-1雷公藤次堿與101.70 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲備液溶液。雷公藤次堿用乙腈系列稀釋為5.13、10.25、25.63、51.25、76.88、102.50、128.13、256.25 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)用乙腈稀釋為101.70 ng·mL-1。

含藥血漿對照品的制備：精密吸取50 μL 混合空白血漿于1.5 mL EP 管中，分別精密加入系列濃度雷公藤次堿及100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)對照品溶液各10 μL，渦旋 混 勻30 s 后 加 入400 μL 甲 醇，渦 旋 混 勻2 min，12000 rpm 離心15 min，取上清150 μL 于進樣瓶中，2 μL 進樣分析。同法制備低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質(zhì)控溶液。

表1 MRM離子對條件

供試品溶液的制備：稱取70 mg HTⅡ于燒杯中，加入適量0.5% CMC-Na 溶液攪拌均勻，定容至175 mL，即得400 μg·mL-1（高劑量）的HTⅡ混懸液；取高劑量混懸液70 mL，加入70 mL 0.5%CMC-Na 溶液，混勻，即得200μg·mL-1（中劑量）的HTⅡ混懸液；取中劑量混懸液50 mL，加入50 mL 0.5% CMC-Na 溶液，混勻，即得100μg·mL-1（低劑量）的HTⅡ混懸液。

2.2 給藥和樣品采集

取Beagle 犬30 只，雌雄各半，分為3 組，每組10只，即高劑量組（400 μg·kg-1）、中劑量組（200 μg·kg-1）、低劑量組（100 μg·kg-1）。將配制好的供試品溶液按1 mL·Kg-1單次灌胃給予，給藥前采集空白血樣，灌胃后于0.5、1、1.5、2、4、6、8、24 h 前臂頭靜脈采血，約取1.5 ml 全血置于入肝素鈉抗凝管中，3000 r·min-1離心10 min，分離血漿，再分為兩管（一管取50μL，剩余血漿放置于另一管，備用），-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜與質(zhì)譜分析條件[14-15]

液相條件：ACE Super C18柱（2.1×100 mm id，5μm，菲羅門），流動相為2 mM 醋酸銨（0.2 %甲酸）（A）：乙腈（B），梯度洗脫（0-0.5 min，15% B；0.5-1.5 min，15%-90% B；1.5-3.6 min，90% B；3.6-3.7 min，90%-15% B；3.7-5.5 min，15% B），體積流量350 μL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量2μL。

質(zhì)譜條件：采用ESI-Positive-MRM 模式，霧化氣（Gas1）：55Psi，輔助氣（Gas2）：55 Psi，源噴射電壓（IS）：5500 V，霧化溫度（TEM）：600°C，CAD：4 Psi，氣簾氣（CUR）：15 Psi，質(zhì)譜條件優(yōu)化如表1。

2.4 血漿樣品的處理與測定

圖1 雷公藤次堿和雷公藤春堿犬血漿樣品的專屬性色譜圖

采用甲醇除蛋白進行前處理：精密移取50 μL 血漿樣品，精密加入水與100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)對照品溶液各10 μL，渦旋混勻30 s 后加入400 μL 甲醇，渦旋混勻2 min，12000 rpm 離心15 min，取上清150 μL 于進樣瓶中，2μL 進樣分析。采用本文中建立的UPLC-MS/MS法測定血漿中雷公藤次堿濃度，DAS3.0分析其主要藥動學(xué)參數(shù)。

3 實驗結(jié)果

3.1 方法專屬性

取對照品儲備液，采用乙腈稀釋，得到102.50 ng·mL-1雷公藤次堿對照品溶液（圖C）與101.70 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)對照品溶液（圖D）。精密移取50 μL 血漿樣品，分別精密量取乙腈（圖A）、水（圖B）、102.50 ng·mL-1雷公藤次堿（圖E）與101.7 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)（圖F）對照品溶液各10μL，按“2.4”項下方法進行除蛋白處理后進樣，離子流圖如圖1，結(jié)果顯示雷公藤次堿和內(nèi)標(biāo)的出峰時間分別為2.99、2.73 min，峰型良好，兩者的分離度好，空白血漿在樣品峰及內(nèi)標(biāo)峰處的干擾小，專屬性強，適用于犬體內(nèi)血漿樣品的測定。

3.2 線性范圍和定量限、檢測限

取對照品儲備液，按“2.1”項下含藥血漿對照品的制備方法，分別制備5.13-256.25 ng·mL-1血漿對照品，取儲備液重復(fù)配制3 組。以3 組對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的平均值為縱坐標(biāo)、對照品的濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2，表明雷公藤次堿與內(nèi)標(biāo)峰面積比值在5.13-256.25 ng·mL 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（r >0.99）。將對照品溶液分別逐步稀釋并進行測定，并以信噪比S/N = 3 和S/N = 10 時各對照品的量作為檢測限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果測得，定量限為4.94 ng·mL-1，檢測限為0.49 ng·mL-1。

表2 線性關(guān)系

3.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別精密吸取5 只Beagle 犬空白血漿各50μL 于EP管中，精密加入純水20μL，渦旋混勻30 s后加入甲醇400 μL，渦旋混勻，12000 rpm 離心15 min，各取上清160 μL 于新的EP 管中，分別精密加入102.50 ng·mL-1的雷公藤次堿及101.70 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)對照品溶液各20μL，渦旋混勻30 s，進樣分析，得峰面積A。分別精密吸取上述相同濃度的雷公藤次堿及內(nèi)標(biāo)對照品溶液各20 μL，加甲醇溶液160 μL，渦旋混勻30 s 后，進樣分析，得峰面積B。以公式B/A×100%計算基質(zhì)效應(yīng)，計算血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)。雷公藤次堿基質(zhì)效應(yīng)分別為80.82%、98.53%、104.46%、115.03%、110.77%，內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)分別為88.64%，100.02%，102.11%，97.10%，91.99%，平均值分別為101.92%、95.97%。表明該檢測方法無明顯離子增強或抑制效應(yīng)。

3.4 精密度及準(zhǔn)確度

取低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質(zhì)控溶液，每個濃度重復(fù)制備5份，分一天和三天重復(fù)測定一批和三批，以當(dāng)日隨行標(biāo)曲計算樣品濃度，計算低、中、高濃度質(zhì)控溶液的一天和三天的批內(nèi)及批間精密度，結(jié)果顯示低中高濃度批內(nèi)精密度的RSD 分別為6.95%，10.73%，9.66%，批間精密度分別為7.83%，5.40%，3.77%，批內(nèi)批間精密度均小于15%；低中高濃度平均回收率分別為113.55%、109.43%、91.10%，RSD 分別為12.14%，9.00%，10.83%，平均回收率均在91.10%-113.55%之間，且RSD 均小于15%。表明該方法精密度及準(zhǔn)確度良好。

3.5 提取回收率

取低、中、高濃度（10.25、51.25、205.00 ng·mL-1）的質(zhì)控溶液，另取對應(yīng)濃度相同的低、中、高3 個濃度的對照品溶液，每個濃度制備5份樣品，每個樣品分析一次，將樣品的檢測信號與未經(jīng)提取處理的相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測信號比較，得到低中高濃度平均提取回收率分別為：112.76%、82.86%、95.72%，提取回收率在82.86%-112.76%之間。

3.6 穩(wěn)定性

制備低、中、高濃度雷公藤次堿對照品，每個濃度平行5份，考察處理過程中的室溫放置12 h的穩(wěn)定性；制備低、中、高濃度雷公藤次堿血漿樣品，每個濃度平行5 份，考察低、中、高濃度含藥血漿樣品除蛋白處理前室溫放置12 h 過程的穩(wěn)定性，考察低、中、高濃度血漿樣品除蛋白處理后樣品盤（4℃）中放置12 h 的穩(wěn)定性，考察低、中、高濃度樣品反復(fù)凍融三次的穩(wěn)定性，考察低、中、高濃度血漿樣品低溫（-80℃）長期放置（10 天）的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3，顯示中、高濃度RSD 均小于15%，低濃度RSD 均小于20%，表明雷公藤次堿各穩(wěn)定性均符合要求。

3.7 雷公藤次堿在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究

雷公藤次堿高、中、低劑量組給藥后，采集各時間點血漿，按“2.4”與“2.3”項下方法處理與測定后，得到犬血漿藥時曲線見圖2；將測得的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用DAS 3.0 軟件處理，雷公藤次堿的藥動學(xué)參數(shù)見表4；藥動學(xué)參數(shù)與劑量和性別比較后結(jié)果見表5。由表可知：Tmax 均在1.1h 左右；高劑量組雄犬、雌犬的AUC（0-24h）為低劑量組的1.84、4.85 倍；中劑量組雄犬、雌犬的AUC（0-24h）為低劑量組的1.40、1.37倍；高劑量組雄犬、雌犬的Cmax為低劑量組的1.99、6.67倍；中劑量組雄犬、雌犬Cmax 為低劑量組的1.17、1.73 倍；而高、中、低劑量組的劑量比為4∶2∶1，表明雷公藤次堿吸收較快，在Beagle 犬體內(nèi)的系統(tǒng)暴露隨劑量的增大而增加，有呈比例增加的趨勢。中低劑量組的AUC（0-24h）與Cmax 的雄雌比分別為1.06、1.03、0.98、1.44倍，而高劑量組的AUC（0-24h）與Cmax 的雄犬/雌犬分別為0.39、0.43，表明除高劑量組給藥后雷公藤次堿在雄性Beagle 犬體內(nèi)的暴露明顯小于雌性外，其余劑量組給藥后雷公藤次堿在雄性Beagle犬和雌性Beagle犬體內(nèi)的系統(tǒng)暴露未見明顯差異。

表3 雷公藤次堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

表3 雷公藤次堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果（ng·mL-1，±SD，n = 5）

考察狀態(tài)0 h對照品室溫放置12 h樣品處理前室溫放置12 h樣品處理后樣品盤放置12 h樣品低溫放置10天反復(fù)凍融穩(wěn)定性3次理論濃度10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200 10 50 200檢測濃度9.07±1.05 50.27±5.47 188.06±16.08 9.22±0.95 47.05±3.21 188.44±10.24 9.93±1.28 46.96±2.64 189.12±15.32 8.76±1.40 50.21±0.67 191.41±16.24 8.99±1.01 47.29±6.15 199.76±10.54 10.46±1.14 47.46±3.24 195.21±14.34 RSD%11.56 10.87 8.55 14.71 7.23 8.40 18.84 10.48 10.81 16.76 5.09 3.54 15.83 9.11 7.84 18.34 10.15 10.18

雄性t1/2z的高中低劑量組均保持在8.5 h 左右，雌性t1/2z的高中低劑量組均保持在5.1 h 左右；雌犬高中低劑量的CLz/F基本無差異，而雄犬的CLz/F隨劑量增大有所增加；表明雷公藤次堿的消除與劑量無關(guān)，與性別有關(guān)。

4 討論

4.1 血漿樣品前處理及色譜條件優(yōu)化

本研究比較了比較了甲醇、乙腈除蛋白效果，發(fā)現(xiàn)甲醇除蛋白后回收率高，且基本無基質(zhì)效應(yīng)，故選擇甲醇作為蛋白沉淀試劑；甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈-甲酸銨甲酸水以及乙腈-乙酸銨甲酸水等流動相，發(fā)現(xiàn)雷公藤次堿在乙腈-甲酸銨甲酸水條件下響應(yīng)最高，且拖尾影響最小，因此選擇乙腈-2 mM醋酸銨含0.2%甲酸水作為流動相。

4.2 劑量設(shè)定

圖2 雷公藤次堿血藥濃度-時間曲線（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次堿在犬血漿中的主要藥動學(xué)參數(shù)（±SD，n = 5）

表4 雷公藤次堿在犬血漿中的主要藥動學(xué)參數(shù)（±SD，n = 5）

注：*為與雄性比較，P<0.05

CLz/F/(L kg-1 h-1)1.78±0.57 0.59±0.43*0.96±0.46 0.63±0.58 0.71±0.35 0.64±0.17組別高劑量組性別中劑量組低劑量組雄雌雄雌雄雌Tmax/h 1.00±0.35 1.30±0.27 1.00±0.41 1.10±0.42 1.10±0.42 1.30±0.45 AUC(0-24 h)/(μg L-1*h)302.5±87.6 772.6±156.6*230.6±104.8 217.9±70.5 164.4±42.6 159.2±48.2 Cmax/(μg L-1)69.3±14.3 161.8±39.8 41.0±15.1 42.0±17.8 34.9±12.7 24.3±8.7 t1/2z/h 8.84±1.41 4.92±1.62 8.69±2.23 4.70±1.42 8.01±1.19 5.88±0.93

表5 雷公藤次堿在犬血漿中藥動學(xué)參數(shù)組別與性別比值分析

雷公藤次堿為雷公藤多苷片的主要成分之一，在雷公藤多苷片中含量約為20 μg·mg-1, 雷公藤多苷片臨床人用劑量最大為1.5 mg·kg-1，折算成犬的等效劑量約為3 mg/Kg，其中雷公藤次堿劑量約為60μg·kg-1?，F(xiàn)報道雷公藤多苷大鼠的生殖毒性[16]、血液系統(tǒng)毒性[17]及肝毒性劑量[18-19]，在94.5-150 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)，折算成雷公藤次堿犬的劑量為529-840 μg·kg-1。綜合文獻雷公藤多苷片在犬血漿中藥代動力學(xué)研究[20]、雷公藤免疫抑制藥效[21]、毒性劑量及根據(jù)新藥非臨床藥代動力學(xué)研究試驗設(shè)計原則，設(shè)計了本文Beagle犬給藥劑量。

4.3 藥動學(xué)

藥動學(xué)結(jié)果顯示高劑量組不同性別的Cmax、AUC(0-24h)差異較大，因此我們選擇將雌雄分開統(tǒng)計。其AUC、Cmax 等隨給藥劑量的增加而增大，有呈比例增長的趨勢，且其t1/2、CLz/F 與劑量無關(guān)，雷公藤次堿在Beagle 犬體內(nèi)的藥動學(xué)過程應(yīng)屬于線性動力學(xué)過程，但高劑量組雄性產(chǎn)生明顯差異，可能由以下幾個方面導(dǎo)致：1.雌雄對雷公藤次堿的消除有差異；2.隨著給藥劑量的增大，雷公藤次堿對犬產(chǎn)生了毒性反應(yīng)；3.在給藥過程中，或樣品前處理過程中帶來了誤差，導(dǎo)致樣品測定結(jié)果產(chǎn)生誤差，導(dǎo)致血藥濃度和用藥劑量不成比例關(guān)系。清除率（CLz/F）變大會導(dǎo)致血藥濃度以及Cmax降低[22]，與雌性比較，高劑量組雄性的CLz/F變大后，AUC 和Cmax 確有不同程度的降低，說明高劑量不僅影響了代謝及排泄，且對吸收也產(chǎn)生了影響。根據(jù)文獻報道雷公藤生物堿類物質(zhì)可損傷肝細胞、破壞紅細胞、引起進行性貧血[23]，雷公藤具有胃腸毒性及腎毒性，而雷公藤次堿的胃腸毒性及腎毒性未見報道。后期可采用長期給藥毒代動力學(xué)試驗進行驗證。本研究雷公藤次堿在犬體內(nèi)藥動學(xué)特征與文獻中報道[20]的基本一致。

本研究建立了一種準(zhǔn)確，靈敏，快速的LC-MS/MS方法，該方法的開發(fā)和驗證成功應(yīng)用于測定Beagle 犬血漿中的雷公藤次堿靈敏度高，響應(yīng)線性好，精密度和準(zhǔn)確度高。在Beagle 犬中首次單獨給予雷公藤次堿并對其藥動學(xué)特征進行了評價，為雷公藤次堿的藥代動學(xué)及毒代動力學(xué)研究提供設(shè)計依據(jù)。