王新斌，戴恩來，薛國忠，呂 娟，陳威辛

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 蘭州 730000）

激素抵抗型腎病綜合征（steroid- resistant nephrotic syndrome，SRNS）是指經(jīng)規(guī)范化激素治療無效的腎病綜合征，屬于難治性腎病綜合征（refractory nephrotic syndrome，RNS）的一種類型[1]，是臨床慢性腎臟病中治療最為棘手，預(yù)后較差的病種。盡管對SRNS 從B 淋巴細胞抑制、抑制纖維化、基因突變等角度的治療有了一定的進展，但臨床療效仍不盡如人意，且副作用堪憂，故進一步探究SRNS 發(fā)病機制，尋找新型藥物治療具有重要的臨床意義。JNK、p38為絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成員，研究顯示，激活JNK/p38 信號通路后，可誘導(dǎo)腎組織纖維細胞增生，加重腎間質(zhì)損傷，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化、腎衰竭，提示JNK/p38信號通路可能為SRNS 潛在治療靶點[2-3]。右歸丸是由炮附片、熟地黃、肉桂、酒萸肉和山藥等中藥組成，具有填精止遺、溫補腎陽之功效，臨床用于治療慢性腎衰、腎病綜合癥等腎病[4]。本研究通過建立SRNS 動物模型，給予右歸丸干預(yù)，旨在探究右歸丸對SRNS 大鼠腎組織的保護作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Wisar 大鼠60 只，雄性，8 周齡，體重（200±10）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，動物合格證號：6200100000025，許可證號：SCXK（甘）2015-0002。動物飼養(yǎng)于SPF實驗中心，室溫22℃，輻照滅菌SPF級大鼠飼料喂養(yǎng)，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物

阿霉素（AD，Solarbio，批號17C024，規(guī)格：25 mg/支）；醋酸潑尼松片（浙江仙據(jù)制藥股份有限公司，批號170146，規(guī)格：5 mg/片）；右歸丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號170528規(guī)格：9 g/丸），藥物成分：綠原酸、莫諾苷松、脂醇二葡萄糖苷、馬錢苷、阿魏酸、肉桂酸（見圖1）。

1.3 主要試劑及儀器

肌酐檢測試劑盒（批號:YZB/GER2659-2018）；尿素氮檢測試劑盒（批號:YZB/GER0315-2018）；總蛋白檢測試劑盒（批號:YZB/GER3253-2018）；白蛋白檢測試劑盒（批號:YZB/GER1029-2018）；甘油三酯檢測試劑盒（批號:YZB/GER5264-2018）；膽固醇檢測試劑盒（批號:YZB/GER1324-2018）均購自Roche Diagnostics GmbH 公司；Masson 染色試劑盒（貨號：G1340）購于美國Solarbio 公司；PAS 染色試劑盒（貨號：DG0007）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；HE 染色試劑盒（貨號：C0105）購自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗鼠Caspase-3（ab179517）、Bcl-2（ab185002）、Bax（ab53154）、β-actin（ab179467）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β,TGF-β1)（ab92486）、結(jié) 締 組 織 生 長 因 子(connective tissue growth factor,CTGF)（ab231824）單 抗抗體購于英國Abcam 公司；p-JNK（AF1205）、JNK（MAB1387）、p-p38（AF8691）、p38（MAB8691）、HRP標(biāo)記二抗（HAF007）購于美國R&D 公司；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司，型號CX41）；全自動生化儀（上?？迫A卓越生物工程股份有限公司，型號：450）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，型號：Gel Doc XR+）。

圖1 HPLC色譜圖

1.4 實驗分組與給藥

1.4.1 模型制備

將60 只雄性SPF 級Wisar 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機分為正常組（10 只）和造模組（50 只）。參照文獻法[5]，建立激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型，造模組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素（6 mg·kg-1）建立激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型，大鼠尾部未發(fā)生腫脹、迂曲，表明注射成功；正常組（Control）大鼠注射等劑量生理鹽水。

1.4.2 動物給藥

造模成功后采用隨機數(shù)字表法分為模型組、激素治療組（潑尼松片，Prednisone）、激素聯(lián)合右歸丸低、中、高組（TL、TM、TH），每組10 只大鼠。依據(jù)人與大鼠體表面積換算法計算用藥量。Control 組和Model組：給予等體積生理鹽水灌胃；Prednisone 組：給予潑尼松片混懸液灌胃，劑量為6.3 mg·kg-1·d-1；Prednisone聯(lián)合右歸丸低、中、高劑量組：給予潑尼松混合右歸丸的混懸液灌胃,劑量分別為6.3/11600mg·kg-1·d-1、6.3/5600 mg·kg-1·d-1、6.3/2800 mg·kg-1·d-1，連續(xù)6周。

1.5 樣本采集、處理

給藥2周、4周、6周，收集大鼠24 h尿液，3000 g離心5 min 后，收集上清液，用于檢測24 h 尿蛋白量。末次治療結(jié)束后，將大鼠麻醉處死，收集血液5000 g，離心5 min，收集上清，在-80℃中保存；收集腎組織，平均分為2 部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片，用于病理觀察以及免疫組化檢測；一部分保存于-80℃用于蛋白檢測。

1.6 檢測指標(biāo)與方法

1.6.1 大鼠一般狀態(tài)

給藥期間，觀察大鼠毛發(fā)、進食量、精神、大便、體重情況等。

1.6.2 血清中血脂、腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測

參照試劑盒檢測血清中肌酐（Serum creatinine，Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、總蛋白（Total protein，TP）、白 蛋 白（Albumin，ALB）、甘 油 三 酯（Triglyceride，TG）、膽固醇（Total Cholesterol，TC）水平，具體參考試劑盒說明書進行操作，于自動生化檢測儀進行測定。24 h 尿蛋白量采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽比色法檢測。

1.6.3 腎組織病理形態(tài)學(xué)檢測

腎組織經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行HE、PAS、Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的病理形態(tài)學(xué)變化。采用半定量積分法對腎組織損傷情況進行評定，主要從腎小球硬化程度、腎小管間質(zhì)損傷程度方面進行評分，每個大鼠至少評價20 個腎小球（皮質(zhì)區(qū)域），每項評分為0 ～4 分，評分越高代表損傷越嚴(yán)重。Masson 染色：膠原纖維染色為藍色，肌纖維染色為暗紅色，采用IPP6.0 分析Masson 染色膠原纖維面積比，膠原纖維比例=染藍區(qū)域面積/總面積×100%。

1.6.4 TUNEL原位凋亡檢測腎組織細胞凋亡情況

制備腎組織冷凍切片，50 μL 蛋白酶K，37℃孵育20 min，加入Tunel反應(yīng)液，于37°C的加濕室中孵育1 h，PBS 緩沖液清洗后，添加過氧化物酶結(jié)合抗體在37°C孵育1 h，DAB 染色后用蘇木精復(fù)染，脫水、封片后，在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，凋亡細胞核染色呈棕色。用Image-J 軟件定量分析細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=棕色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6.5 免疫印跡法檢測腎組織中JNK/p38 信號通路、凋亡蛋白表達

取適量腎組織，添加RIPA裂解液冰上反應(yīng)30 min，提取腎組織總蛋白，BCA 檢測蛋白含量，取50ug 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉后加入兔抗鼠TGF-β1、CTGF、Caspase-3、Bcl-2、Bax、βactin、p-JNK、JNK、p-p38、p38 一抗（1:500），4℃搖床孵育過夜，PBS 緩沖液清洗后，，加入HRP 標(biāo)記二抗孵育膜（1:5000），清洗后，于膜上加入ECL 反應(yīng)液5 min后進行曝光、顯影，用凝膠成像儀采集、保存圖像，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image-J 軟件定量分析各蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩對比采用SNK-q 檢驗，當(dāng)P<0.05時，則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組大鼠體重變化情況比較（±s，g）

表1 各組大鼠體重變化情況比較（±s，g）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

給藥6周370.2±12.93 251.2±8.45*254.9±2.47*263.2±6.86△▲*260.9±5.37△▲*267.3±5.28△▲*組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 10 9 10 10給藥2周290.34±11.1 230.62±7.83*233.0±.5.78 232.87±9.36 235.86±4.25 239.65±4.39給藥4周320.26±12.46 245.38±7.15 252.33±4.06△*257.42±7.36△▲*259.37±5.57△▲*263.92±4.93△▲*

表2 各組24 h尿蛋白量比較(±s，mg)

表2 各組24 h尿蛋白量比較(±s，mg)

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

用藥后6周5.32±1.34 181.64±5.49*175.27±7.39*37.09±5.41▲△*35.23±4.14▲△*38.2±6.77▲△*組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 9 9 1 0 10用藥后2周5.15±1.29 150.31±3.54*142.20±3.95*83.41±3.47▲△*92.10±2.13▲△*87.76±2.07▲△*用藥后4周4.75±1.13 175.27±4.52*170.34±6.98*57.60±5.23▲△*61.38±5.40▲△*59.65±6.27▲△*

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

Control 組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光滑發(fā)亮，進食正常。造模后第7 d 大鼠出現(xiàn)尿量減少并伴有少量的腹水，精神狀態(tài)日漸萎靡，進食減少，體重下降。1-2 周大鼠腹水顯著增多，24 h 尿蛋白增多；大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲鈍，有弓背聳肩現(xiàn)象，蜷臥少動，體毛發(fā)灰發(fā)暗，大便稀溏等體征。Control 組無大鼠死亡；Model組2只大鼠因腹水、進食減少死亡，死亡率20%（2/10）。TL 組、TM 組、TH 組各有1 只因腹水、體重下降而死亡，Prednisone 組1 只死亡。與Model 組相比，TL 組、TM 組、TH 組、Prednisone 組大鼠活躍度增加，精神好轉(zhuǎn)，毛發(fā)漸有光澤。隨著給藥時間的延長，大鼠體重逐漸增加，給藥2周，與Control組相比，Model組體重降低；給藥4 周、6 周，與Model 組、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH 組組體重升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表1）。

2.2 各組大鼠尿蛋白定量變化

與Control組相比，Model組24 h尿蛋白量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH 組24 h 尿蛋白量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05）（見表2）。

表3 各組血清腎功能、血脂水平比較（±s）

表3 各組血清腎功能、血脂水平比較（±s）

注：與Control組比較，*P<0.05；與Model組比較，△P<0.05；與Prednisone組比較，▲P<0.05

LDH（U/L）48.65±8.91 85.82±9.68*78.36±5.03*64.42±4.22*△▲60.18±5.09*△▲57.65±6.91*△▲組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 9 9 1 0 10 TP/（g/L）69.75±1.85 46.33±2.12*44.55±2.97*55.47±1.78*△▲56.35±2.27*△▲57.51±3.89*△▲ALB/（g/L）47.76±1.96 20.62±3.97*23.54±2.95*37.23±2.18*△▲36.45±3.15*△▲38.62±4.71*△▲TC/(mmol/L)0.94±0.23 1.67±0.34*1.45±0.19*1.18±0.17*△▲1.32±0.16*△▲1.16±0.40*△▲TG/(mmol/L)1.07±0.34 2.74±0.47*2.96±0.46*1.65±0.17*△▲1.76±0.12*△▲1.57±0.15*△▲Scr/(mmol/L)36.10±2.55 96.5±4.55*95.10±2.13*76.10±1.62*△▲77.41±2.17*△▲75.87±2.58*△▲BUN/(mmol/L)7.90±1.36 17.47±1.23*16.90±1.37*12.37±0.90*△▲12.60±1.31*△▲11.81±0.52*△▲

圖2 HE染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化（200×）

2.3 各組血清血脂、腎功能有關(guān)指標(biāo)變化情況

與Control 組相比，Model 組TP、ALB 水平降低，TC、TG、Scr、BUN、LDH 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM組、TH組血清TP、ALB水平升高，TC、TG、Scr、BUN、LDH水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見表3）。

2.4 HE染色檢測大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)

Control 組腎小球、腎小管基本正常，球內(nèi)毛細血管結(jié)構(gòu)清晰；Model 組腎小球囊粘連，細胞增生明顯，周圍間質(zhì)內(nèi)較多炎細胞浸潤，毛細血管內(nèi)呈均質(zhì)狀透明樣變，腎小管上皮細胞變性，管腔內(nèi)均有透明管型。經(jīng)激素及與右歸丸聯(lián)合治療后腎小球、腎小管損傷得到一定的改善，病理損傷程度減輕。與Control 組相比，Model 組腎小球硬化評分、腎小管間質(zhì)損傷評分、膠原纖維比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH 組腎小球硬化評分、腎小管間質(zhì)損傷評分、膠原纖維比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（見圖2、圖3、圖4和表4）。

2.5 腎組織細胞凋亡情況

與Control 組相比，Model 組腎組織細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與Model、Prednisone組相比，TL 組、TM 組、TH 組腎組織凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖5、表5）。

2.6 腎臟組織中纖維化蛋白表達情況

與Control 組相比，Model 組TGF-β1、CTGF 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH 組TGF-β1、CTGF蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（見圖6、表6）。

2.7 腎臟組織中JNK/p38信號通路蛋白表達情況

與Control 組相比，Model 組JNK、p38 蛋白磷酸化水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH 組JNK、p38 蛋白磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖7、表7）。

2.8 腎臟組織中凋亡蛋白表達情況

圖3 Masson染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化（200×）

圖4 PAS染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化（200×）

圖5 Tunel聯(lián)合免疫組化檢測腎組織凋亡情況（100×）

表4 各組腎組織損傷評分比較（±s）

表4 各組腎組織損傷評分比較（±s）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

膠原纖維比例/%2.16±0.53 58.33±6.49*52.98±7.32*41.87±6.13*△▲38.63±5.41*△▲36.48±4.22*△▲組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 9 9 1 0 10腎小球硬化評分0.24±0.03 2.79±0.53*2.58±0.75*1.43±0.42*△▲1.52±0.34*△▲1.59±0.46*△▲腎小管間質(zhì)損傷評分/分0.41±0.05 3.26±0.54*3.14±0.59*1.76±0.35*△▲1.68±0.34*△▲1.55±0.26*△▲

表5 各組腎組織凋亡率比較（±s，%）

表5 各組腎組織凋亡率比較（±s，%）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

凋亡率3.61±0.88 37.66±4.39*34.42±4.83*25.76±2.36*△▲24.44±2.93*△▲22.13±2.85*△▲組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 9 9 1 0 10

圖6 免疫印跡法檢測腎臟組織中TGF-β1、CTGF信號通路蛋白表達

表6 各組腎組織中TGF-β1、CTGF信號通路蛋白表達比較（±s）

表6 各組腎組織中TGF-β1、CTGF信號通路蛋白表達比較（±s）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

CTGF/β-actin 0.24±0.05 0.91±0.12*0.86±0.09*0.52±0.06*△▲0.34±0.04*△▲0.31±0.03*△▲組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N 10 8 9 9 1 0 10 TGF-β1/β-actin 0.12±2.39 1.82±0.41*1.64±0.39*0.73±0.08*△▲0.35±0.04*△▲0.33±0.03*△▲

與Control 組相比，Model 組Caspase-3、Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與Model、Prednisone 組相比，TL 組、TM 組、TH組Caspase-3、Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖8、表8）。

圖7 免疫印跡法檢測腎臟組織中JNK/p38信號通路蛋白表達

表7 各組腎組織中JNK/p38信號通路蛋白表達比較（±s）

表7 各組腎組織中JNK/p38信號通路蛋白表達比較（±s）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

N 10 p-p38/p38 0.38±0.05 1.14±0.23*1.06±0.18*0.76±0.14*△▲0.69±0.03*△▲0.65±0.05*△▲組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組8 9 9 1 0 10 p-JNK/JNK 0.31±0.03 1.05±0.16*0.97±0.12*0.48±0.06*△▲0.41±0.04*△▲0.45±0.06*△▲

圖8 免疫印跡法檢測腎臟組織中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達情況

表8 各組腎組織凋亡蛋白表達比較（±s）

表8 各組腎組織凋亡蛋白表達比較（±s）

注：與Control 組比較，*P < 0.05；與Model 組比較，△P < 0.05；與Predni?sone組比較，▲P<0.05

10組別Control組Model組Prednisone組TL組TM組TH組N Bcl-2/β-actin 1.38±0.14 0.21±0.06*0.43±0.08*0.61±0.07*△▲0.43±0.08*△▲0.32±0.03*△▲10 8 9 9 1 0 Caspase-3/β-actin 0.32±0.04 1.34±0.19*1.18±0.14*0.76±0.09*△▲0.73±0.07*△▲0.74±0.08*△▲Bax/β-actin 0.86±0.11 1.17±0.13*0.75±0.07*0.51±0.08*△▲0.38±0.05*△▲0.25±0.02*△▲

3 討論

阿霉素為癌癥化療藥物，能夠從DNA 水平干預(yù)足突細胞DNA 生成，導(dǎo)致足突細胞變異，引發(fā)腎細胞損傷；此外，阿霉素還能夠誘發(fā)腎小球上皮細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞腎小球濾膜結(jié)構(gòu)，形成蛋白尿，是目前腎病綜合征動物模型常用的化學(xué)藥物[6]。既往學(xué)者采用阿霉素制備腎病綜合征大鼠發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)大量蛋白尿，腎水腫、高血脂等腎病綜合征典型特征[7]，與臨床人腎病綜合征臨床表現(xiàn)相似。本研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素后，經(jīng)HE 染色發(fā)現(xiàn)與Control組相比，Model 組大鼠腎小球、腎小管發(fā)生明顯病理損傷，腎組織損傷評分升高，膠原纖維比例升高，24 h 尿蛋白含量明顯升高，血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)大鼠血清TP、ALB 水平降低，TC、TG、Scr、BUN、LDH 水平升高，纖維化蛋白TGF-β1、CTGF 表達升高，進一步表明大鼠蛋白代謝、脂代謝異常、腎功能發(fā)生障礙，與腎綜合征大鼠模型制備結(jié)果相似[8]，提示SRNS 大鼠模型復(fù)制成功。

在腎病發(fā)生過程中，會發(fā)生“溺毒”“腎勞”“腎風(fēng)”等情況，患者主要表現(xiàn)為正虛邪實，因此中醫(yī)認(rèn)為，脾腎陽虛是腎綜合征疾病的治療目的。右歸丸出自《景岳全書》，屬于補腎代表方，臨床藥理學(xué)研究顯示其能夠緩解哮喘、增強機體免疫力，改善大鼠邊緣系統(tǒng)等[9]。熊霞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸能夠降低腎衰竭患者血清中BUN 腎功能指標(biāo)水平，改善腎功能并提高免疫力，降低炎癥反應(yīng)，進而緩解病情進展。于化新等[11]研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸可降低腎衰大鼠血清中Scr、BUN 水平，改善腎損傷，延緩腎衰的發(fā)生。上述研究說明，右歸丸對腎病具有一定的緩解作用。本研究顯示，經(jīng)Prednisone 治療后大鼠腎組織損傷、血清蛋白、脂代謝指標(biāo)變化并不顯著，而經(jīng)Prednisone 聯(lián)合右歸丸治療后，病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)腎小球、腎間質(zhì)損傷得到一定的改善，血清TP、ALB 水平升高，TC、TG、Scr、BUN、LDH水平、纖維化蛋白TGF-β1、CTGF 表達降低，提示右歸丸能夠緩解SRNS 大鼠腎功能損傷，改善脂代謝、蛋白代謝。

MAPK 信號通路在細胞增殖、分化、應(yīng)激、炎癥等生理病理過程調(diào)控中發(fā)揮重要作用，JNK、p38 為通路主要成員，研究發(fā)現(xiàn)，在腎纖維化進展中，受到炎癥刺激等可激活p38，使其發(fā)生磷酸化，且p38 磷酸化水平與氧化應(yīng)激程度、纖維化程度密切相關(guān)[12-13]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，激活Hk-2細胞中JNK信號通路后能夠加速LPS 誘發(fā)的急性腎損傷。Yoon 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，外源性cgrp 通過調(diào)控腎近端小管細胞中的cgrp 受體/pkc/jnk 信號通路，進而加速腎小管纖維化的方發(fā)生。Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制JNK/p38 MAPK 信號通路和干擾氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠腎缺血再灌注損傷，保護腎功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Model組大鼠腎組織中p38、JNK 蛋白磷酸化水平明顯升高，推測JNK/p38 信號通路可能與SRNS 的發(fā)生有關(guān)。陳葉香等[17]研究發(fā)現(xiàn)右歸丸通過抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 過程進而緩解腎間質(zhì)纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Prednisone聯(lián)合右歸丸治療后，大鼠腎組織中p38、JNK蛋白磷酸化水平明顯降低，提示右歸丸對SRNS 大鼠腎功能的恢復(fù)可能是通過對JNK/p38信號通路的抑制來實現(xiàn)的。

腎組織細胞凋亡伴隨著腎病發(fā)生發(fā)展，存在腎病的損傷及修復(fù)過程中。本研究通過采用Tunel 染色檢測SRNS腎組織細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，Model 組、Prednisone 組大鼠腎組織細胞凋亡率明顯增加，經(jīng)右歸丸干預(yù)后，細胞凋亡率明顯降低，推測右歸丸具有抗腎組織細胞凋亡的作用。Bax、Bcl-2蛋白是研究較多的凋亡蛋白，研究證實Bax/Bcl-2 通路參與腎組織細胞凋亡[18]，而Caspase-3是細胞凋亡的最終執(zhí)行者[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與control 組相比，Model組腎組織中Caspase-3、Bax 蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達降低，經(jīng)右歸丸干預(yù)后，腎組織中Caspase-3、Bax 蛋白表達顯著降低，Bcl-2 蛋白表達降低升高，推測右歸丸可通過降低腎細胞凋亡進而發(fā)揮對腎臟的保護作用。

綜上所述，右歸丸能夠緩解SRNS 大鼠腎組織損傷，保護腎功能，其可能是通過抑制Jnk/p38 信號通路，降低腎細胞凋亡實現(xiàn)的，然而，SRNS 發(fā)病機制較復(fù)雜，右歸丸是否還可能通過其他途徑發(fā)揮作用，還有待后續(xù)深入研究。