郭銀雪，胡茂蓉，葛平玉

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 貴陽 550001）

急性腎衰是常見的急危重癥，發(fā)生率占ICU 的3-16%，腎衰導(dǎo)致腎器官無法完成正常活動而影響機(jī)體功能正常進(jìn)行，病情嚴(yán)重但目前尚無有效的治療方法方法，且尚不能預(yù)防高危病人急性腎衰的發(fā)生[1]，及早治療急性腎衰對于機(jī)體健康意義重大。治療急性腎衰中采取有效措施防止腎小球上皮細(xì)胞損害是救治的關(guān)鍵，可避免進(jìn)一步器官衰竭從而達(dá)到緩解疾病目的[2]。腎茶作為草藥，用于治療急、慢性腎炎等疾病，其提取物在腎炎利尿、排毒等方面具有功效[3]。腎茶黃酮作為腎茶提取物之一，可抑制氧化應(yīng)激從而緩解大鼠慢性細(xì)菌性前列腺炎[4]。另外研究發(fā)現(xiàn)，急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，從而加速疾病進(jìn)程[5]，腎茶黃酮是否可緩解細(xì)胞凋亡從而實(shí)現(xiàn)對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)，目前尚不明確。因此，本研究立項(xiàng)貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目，建立急性腎衰模型，提取腎小管上皮細(xì)胞，腎茶黃酮處理，檢測腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞的影響，以期為臨床上急性腎衰的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

腎茶（豪州市常福藥業(yè)銷售有限公司），黃酮本實(shí)驗(yàn)室自行提純，腎茶取25 mg，加乙醇后超聲處理溶解，準(zhǔn)確稱量本品，自“加水至6 mL”法測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)品，參照《中國藥典》（2015年版一部）[6]收集“山楂葉”中總黃酮含量測定方法測定波長500 nm 處光密度（optic density，OD）。

甘油（麥克林，貨號：56-81-5）；CCK-8 試劑盒、Annexin V-PE 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（碧云天生物科技有 限 公 司，貨 號 分 別 為：C0037、C1065L、S0116、S1031）；一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinasparate protease，caspase）3、caspase9、B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，BAX）（抗兔）、TGF-β1、smad3（美國abcam，貨號分別為：ab13847、ab202068、ab182858、ab32503、ab92486、ab40854）。酶標(biāo)儀（美國Awareness，型號4700）；流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司，型號：CytoFLEX）；蛋白凝膠成像儀（上海Tanon公司，型號4800）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物模型建立并驗(yàn)證

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康SD 大鼠購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（黔）2015 0001，重量（220±20）g，60 日齡，所有大鼠均在溫度（22 ± 2）℃、濕度（55 ±2）%、12 h/12 h（光照/黑暗）實(shí)驗(yàn)動物中心常規(guī)飼養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理協(xié)會審核并通過。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物建立急性腎衰模型

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]建立6 只大鼠急性腎衰模型，10 mL·kg-150%甘油生理鹽水注射大鼠兩后肢，24 h后急性腎衰組大鼠血清中BUN、Cr 水平升高；腎衰組腎間質(zhì)血管壞死、炎性細(xì)胞浸潤，模型建立成功。對照組大鼠用生理鹽水代替。

1.3 分離急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞并經(jīng)腎茶黃酮處理

1.3.1 腎小管上皮細(xì)胞的分離及鑒定

1.2.2 模型組和對照組大鼠取部分腎組織，放入表面有膠原的培養(yǎng)瓶中，添加DMEM 培養(yǎng)基和F-12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至融合傳代培養(yǎng)，參考文獻(xiàn)[8]觀察腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.2 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞的處理

急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞分為模型組、（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組。腎小管上皮細(xì)胞均勻接種于6 孔板和96 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%時，（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組根據(jù)文獻(xiàn)[9]添加對應(yīng)劑量腎茶黃酮；對照組和模型組培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

1.3.2 中96 孔板各組細(xì)胞分別在處理（0、3、6、12、24、36）h 加CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔細(xì)胞OD值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡能力

1.3.2中6孔板細(xì)胞處理24 h，每孔取2×105個，按照Annexin V-FITC 試劑盒說明書，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 試劑盒檢測SOD、MDA水平

1.3.2 中6 孔板細(xì)胞處理24 h，嚴(yán)格按照SOD 活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒步驟酶標(biāo)儀檢測SOD活性、MDA水平。

1.3.6 蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中caspase3、caspase9、BCL2、BAX、TGF-β1、Smad3蛋白水平

1.3.2 中6 孔板細(xì)胞處理24h 提取細(xì)胞總蛋白，每孔上樣25 ng，分離膠分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應(yīng)加入一抗caspase3（1:500）、caspase9（1:2000）、BCL2（1:2000）、BAX（1:1000）、TGFβ1（1:500）、Smad3（1:1000）、GADPH（1:5000），4℃孵育過夜；對應(yīng)加入二抗，室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組內(nèi)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，在細(xì)胞培養(yǎng)（3、6、12、24、36）h，模型組OD450（0.92 ± 0.12 VS 0.36 ± 0.06、1.64 ± 0.11 VS 0.46 ± 0.11、1.86 ± 0.09 VS 0.58 ± 0.06、2.06 ± 0.12 VS 0.61 ± 0.06、2.42 ± 0.15 VS 0.64 ± 0.15）降 低（P <0.05）。與模型組相比，在細(xì)胞培養(yǎng)6h，（200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組OD450（0.46± 0.11 VS 0.49 ± 0.01、0.53 ± 0.03、0.62 ± 0.01）升高（P < 0.05）；在細(xì)胞培養(yǎng)（12、24、36）h，（300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組OD450（0.58±0.06 VS1.36±0.16、1.43±0.01，0.61±0.06 VS 1.76 ± 0.06、1.81 ± 0.06，0.64 ± 0.15 VS 1.89 ± 0.06、2.13 ± 0.15）升高（P < 0.05）。隨腎茶黃酮劑量增加，OD450水平隨時間延長逐漸升高（P < 0.05），呈劑量依賴性。詳見圖1。

2.2 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，模型組、（100、200、300）μg·mL-1腎茶黃酮組細(xì)胞凋亡率（5.11 ± 0.69 VS 31.26 ± 4.18、19.39±2.06、8.63±1.23、6.22±0.68）升高（P<0.05）。與模型組相比，（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組細(xì)胞凋亡率（31.26 ± 4.18 VS 19.39 ± 2.06、8.63 ±1.23、6.22 ± 0.68、5.69 ± 1.20）降低（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見圖2、表1。

2.3 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞MDA、SOD活性的影響

與對照組相比，模型組、（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組SOD 活性（669.61±81.02 VS 1659.52±395.16、1342.03 ± 286.51、1156.19 ± 199.65、923.51 ±52.06、747.62 ± 36.88）升高；模型組、（100、200）μg·mL-1腎茶黃酮組MDA活性（543.16±62.35 VS 225.51±43.41、394.13±54.69、456.47±69.87）降低（P<0.05）。與模型組相比，（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組細(xì)胞MDA 水平（225.51 ± 43.41 VS 394.13 ± 54.69、456.47 ± 69.87、498.68 ± 56.52、526.16 ± 48.77）升高（P < 0.05）；（200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組細(xì)胞SOD 水 平（1659.52 ± 395.16 VS 1156.19 ± 199.65、923.51 ± 52.06、747.62 ± 36.88）降低（P < 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見表2。

圖1 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響

2.4 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、caspase9、BCL2、BAX蛋白水平的影響

與對照組相比，模型組caspase3、caspase9、BAX（0.12 ± 0.06 VS 0.86 ± 0.21，0.21 ± 0.03 VS 0.94 ±0.19，0.31 ± 0.01 VS 1.02 ± 0.21），（100、200、300）μg·mL-1腎茶黃酮組caspase3、BAX 水平（0.12 ± 0.06 VS 0.87 ± 0.17、0.34 ± 0.09、0.38 ± 0.04，0.31 ± 0.01 VS 1.05 ± 0.17、0.46 ± 0.06、0.42 ± 0.09）升高（P < 0.05），模型組、（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組BCL2水平（1.02 ± 0.11 VS 0.06 ± 0.03、0.05 ± 0.02、0.15 ±0.06、0.21±0.02、0.33±0.04）降低（P<0.05）。與模型組相比，（200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組caspase3、caspase9、BAX（0.86±0.21 VS 0.34±0.09、0.38±0.04、0.11 ± 0.03，0.94 ± 0.19 VS 0.15 ± 0.04、0.05 ± 0.01、0.06 ± 0.02，1.02 ± 0.21 VS 0.46 ± 0.06、0.42 ± 0.09、0.20 ± 0.04），BCL2 水平（0.06 ± 0.03 VS 0.15 ± 0.06、0.21 ± 0.02、0.33 ± 0.04）升高（P < 0.05），100 μg·mL-1腎茶黃酮組caspase9 水平（0.94±0.19 VS 0.13±0.03）降低（P<0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。詳見圖3、表3。

2.5 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞TGF-β 1/Smad3通路的影響

與對照組相比，模型組、（100、200）μg·mL-1腎茶黃酮組TGF-β1、Smad3（0.23 ± 0.03 VS 0.76 ± 0.13、0.62 ± 0.06、0.31 ± 0.02，0.06 ± 0.01 VS 0.48 ± 0.05、0.32 ± 0.06、0.24 ± 0.01），300 μg·mL-1腎 茶 黃 酮 組Smad3（0.06±0.01 VS 0.11±0.03）水平升高（P<0.05）。與模型組相比，（0、100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組TGF-β1、Smad3 水平（0.76±0.13 VS 0.62±0.06、0.31 ± 0.02、0.21 ± 0.02、0.11 ± 0.01，0.48 ± 0.05 VS 0.32 ± 0.06、0.24 ± 0.01、0.11 ± 0.03、0.06 ± 0.02）降低（P<0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。詳見圖4、表4。

圖2 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響（n = 6,± s）

表1 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響（n = 6,± s）

注：與對照組相比，aP < 0.05；與模型組相比，bP < 0.05；與100 μg·mL-1腎茶黃酮組相比，cP<0.05；與200μg·mL-1腎茶黃酮組相比，dP<0.05。

組別對照組模型組100μg·mL-1腎茶黃酮組200μg·mL-1腎茶黃酮組300μg·mL-1腎茶黃酮組400μg·mL-1腎茶黃酮組凋亡率/%5.11±0.69 31.26±4.18a 19.39±2.06ab 8.63±1.23abc 6.22±0.68abcd 5.69±1.20bcd

3 討論

急性腎衰是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，腎小球?yàn)V過能力下降，使BUN、Cr等在體內(nèi)積累誘發(fā)酸堿、電解質(zhì)平衡破壞，研究表明BUN、Cr 水平越高則機(jī)體越紊亂[10]；與中醫(yī)祖國醫(yī)學(xué)稱“關(guān)格”、“癮畢”、“溺毒”、“腎勞”、“水腫”、“消咳”之證候相吻合[11]，是中醫(yī)內(nèi)科急癥之一，溫補(bǔ)心腎、化瘀利水可使病機(jī)扭轉(zhuǎn)，病情緩解。腎茶又稱“貓須草”或“貓須公”，其成分黃酮有利尿、抗氧化之功效[12]，毒性小且安全性高。腎茶在治療慢性腎衰竭時可緩解BUN、Cr 等水平，對慢性腎衰有一定治療作用[13]，但腎茶中黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)揮作用尚不明確。急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞損傷嚴(yán)重、出現(xiàn)凋亡癥狀，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激嚴(yán)重造成機(jī)體損害[14-15]。腎茶黃酮處理急性腎衰腎小管上皮細(xì)胞是否可緩解的細(xì)胞損傷狀態(tài)，對急性腎衰腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)作用。

表2 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞MDA、SOD活性的影響（n = 6,±s）

表2 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞MDA、SOD活性的影響（n = 6,±s）

注：與對照組相比，aP < 0.05；與模型組相比，bP < 0.05；與100 μg·mL-1腎茶黃酮組相比，cP<0.05；與200μg·mL-1腎茶黃酮組相比，dP<0.05；與300μg·mL-1腎茶黃酮組相比，eP<0.05。

組別對照組模型組100μg·mL-1腎茶黃酮組200μg·mL-1腎茶黃酮組300μg·mL-1腎茶黃酮組400μg·mL-1腎茶黃酮組MDA（nmol·g-1蛋白）543.16±62.35 225.51±43.41a 394.13±54.69ab 456.47±69.87ab 498.68±56.52bc 526.16±48.77bc SOD（U·g-1蛋白）669.61±81.02 1659.52±395.16a 1342.03±286.51a 1156.19±199.65ab 923.51±52.06abc 747.62±36.88abcde

表3 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、caspase9、BCL2、BAX的影響（n = 6,±s）

表3 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、caspase9、BCL2、BAX的影響（n = 6,±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與100μg·mL-1腎茶黃酮組相比，cP<0.05；與200μg·mL-1腎茶黃酮組相比，dP<0.05；與300μg·mL-1腎茶黃酮組相比，eP<0.05。

組別對照組模型組100μg·mL-1腎茶黃酮組200μg·mL-1腎茶黃酮組300μg·mL-1腎茶黃酮組400μg·mL-1腎茶黃酮組caspase3 0.12±0.06 0.86±0.21a 0.87±0.17a 0.34±0.09abc 0.38±0.04abc 0.11±0.03bcde caspase9 0.21±0.03 0.94±0.19a 0.13±0.03b 0.15±0.04b 0.05±0.01bcd 0.06±0.02bcd BCL2 1.02±0.11 0.06±0.03a 0.05±0.02a 0.15±0.06abc 0.21±0.02abcd 0.33±0.04abcde BAX 0.31±0.01 1.02±0.21a 1.05±0.17a 0.46±0.06abc 0.42±0.09abc 0.20±0.04bcde

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組OD450降低，凋亡率增加，SOD 活性升高，MDA 水平降低；提示急性腎衰導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞增殖降低、細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，氧化應(yīng)激加重。與模型組相比，細(xì)胞培養(yǎng)（6、12、24、36）h（300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組OD450升高，（100、200、300、400）μg·mL-1腎茶黃酮組細(xì)胞凋亡率降低，SOD 活性降低，MDA 水平升高；提示腎茶黃酮可緩解急性腎衰導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞增殖降低、凋亡現(xiàn)象明顯，氧化應(yīng)激加重現(xiàn)象，且隨著劑量的增加，該緩解效果越明顯。推測可能是腎茶黃酮具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、抑制氧化應(yīng)激從而減緩細(xì)胞損傷狀態(tài)，從而恢復(fù)腎小球?yàn)V過功能，實(shí)現(xiàn)對急性腎衰腎小管上皮細(xì)胞保護(hù)。

BAX與BCL2都為BCL2家族成員，其中BAX作為促凋亡基因、BCL2 作為抗凋亡基因，二者相互作用影響細(xì)胞凋亡[16-17]。在腎小管上皮細(xì)胞損傷中，凋亡蛋白caspase-3[18]、caspase-9[19]水平升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；caspase3、caspase9、BCL2、BAX 作為凋亡蛋白，水平均可反映腎小管上皮細(xì)胞凋亡狀態(tài)[20]。TGF-β1/Smad3通路TGF-β1 可以活化下游Smad3 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，同時可介導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響疾病，在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)升高可加重疾病進(jìn)程[21]；可抑制氧化應(yīng)激保護(hù)大鼠糖尿病心臟組織從而實(shí)現(xiàn)對糖尿病的緩解作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組caspase3、caspase9、BAX、TGF-β1、Smad3水平升高，BCL2 水平降低；提示腎衰竭中腎小管上皮細(xì)胞中促凋亡蛋白水平升高、抗凋亡蛋白水平升高，TGF-β1/Smad3 通路蛋白水平升高從而加速腎小管上皮細(xì)胞凋亡，加重病情。與模型組相比，腎茶黃酮各劑量組隨著劑量的增加，caspase3、caspase9、BAX、TGF-β1、Smad3 水平降低，BCL2 水平升高，可能腎茶黃酮通過抑制TGF-β1 表達(dá)從而抑制Smad3 活化從而抑制凋亡蛋白表達(dá)、促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞氧化應(yīng)激，同時促進(jìn)細(xì)胞增殖可能從而緩解BUN、Cr水平、使電解質(zhì)平衡逐漸恢復(fù)，實(shí)現(xiàn)對急性腎衰腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)。

圖3 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、caspase9、BCL2、BAX的影響

圖4 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1/Smad3通路的影響

表4 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、Smad3的影響（n = 6,±s）

表4 腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、Smad3的影響（n = 6,±s）

注：與對照組相比，aP < 0.05；與模型組相比，bP < 0.05；與100 μg·mL-1腎茶黃酮組相比，cP<0.05；與200μg·mL-1腎茶黃酮組相比，dP<0.05；與300μg·mL-1腎茶黃酮組相比，eP<0.05。

組別對照組模型組100μg·mL-1腎茶黃酮組200μg·mL-1腎茶黃酮組300μg·mL-1腎茶黃酮組400μg·mL-1L腎茶黃酮組TGF-β1 0.23±0.03 0.76±0.13a 0.62±0.06ab 0.31±0.02abc 0.21±0.02bcd 0.11±0.01bcde Smad3 0.06±0.01 0.48±0.05a 0.32±0.06ab 0.24±0.01abc 0.11±0.03abcd 0.06±0.02bcde

綜上所述，腎茶黃酮可實(shí)現(xiàn)對急性腎衰腎小球上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，可能是通過抑制TGF-β1/Smad3通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖、抑制凋亡，抑制氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。但具體對細(xì)胞增殖、凋亡的影響卻不清楚。本文只初步探討了腎茶黃酮對急性腎衰中腎小管上皮細(xì)胞的研究，且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需在體內(nèi)試驗(yàn)加以驗(yàn)證。