程運(yùn)杰，王曉麗，常向云

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2 浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江 杭州 310030； 3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002)

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是一組以多種心血管代謝危險(xiǎn)因素聚集為特征的臨床癥候群，是2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的易感因素[1]。目前，臨床對(duì)于MS的病因、發(fā)病機(jī)制、定義以及診斷標(biāo)準(zhǔn)等尚未達(dá)成統(tǒng)一。學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)為MS的主要發(fā)病機(jī)制是中心性肥胖和胰島素抵抗，但是這一觀點(diǎn)并不能全面解釋MS的所有情況。脂肪組織分為皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪，真正與MS的發(fā)生密切相關(guān)的是內(nèi)臟脂肪的聚集而非皮下脂肪[2]。近年來(lái)有學(xué)者提出，MS是一種亞臨床炎癥狀態(tài)，炎癥可能是肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病以及MS各組分的重要聯(lián)結(jié)點(diǎn)[3]。恒定自然殺傷T(invariant nature killer T,iNKT)細(xì)胞是一類(lèi)特殊T淋巴細(xì)胞亞群，能夠通過(guò)多種代謝和免疫途徑調(diào)控免疫反應(yīng)，參與維持脂肪組織內(nèi)免疫環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞與脂肪組織炎癥反應(yīng)密切有關(guān)[5]。目前，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)iNKT細(xì)胞與MS的關(guān)系的相關(guān)研究。本研究擬探討MS患者外周血iNKT細(xì)胞的變化及其與內(nèi)臟脂肪的關(guān)系，了解iNKT細(xì)胞在MS發(fā)病過(guò)程中的作用，以期為MS的臨床干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

入選2016年1月—2017年12月在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的MS患者80例，其中男性43例，女性37例，年齡(35-75)歲，平均(55.2±9.3)歲。MS的診斷根據(jù)2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制定的代謝綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以下五項(xiàng)符合3項(xiàng)及以上即診斷[6]：(1)腹型肥胖：腰圍男性≥90 cm，女性≥85 cm；(2)高血糖：空腹血糖≥6.1 mmol/L，或糖負(fù)荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L和(或)已確診為糖尿病并治療者。(3)高血壓：血壓≥130/85 mmHg及(或)已確認(rèn)為高血壓并治療者。(4)空腹TG≥1.7 mmol/L。(5)空腹HDL-C<1.04 mmol/L。MS患者依據(jù)體重指數(shù)(BMI)分兩組，MS-1組：BMI ≥ 25 kg/m2，共43例，其中男性21例，女性22例；MS-2組：25 kg/m2>BMI ≥ 18.5 kg/m2，共37例，其中男性22例，女性15例。另選同期在我院體檢的60例健康志愿者作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠或哺乳期婦女、嚴(yán)重的心、肝、腎臟疾病，惡性腫瘤，甲狀腺疾病(甲狀腺功能亢進(jìn)癥或甲狀腺功能減退癥)，自身免疫性疾病，服用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素，急性感染性疾病。三組性別構(gòu)成、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料及生化指標(biāo)檢測(cè)

囑研究對(duì)象空腹、排尿后測(cè)身高、體質(zhì)量；站立位，經(jīng)肋弓下緣和髂嵴上緣的連線中點(diǎn)繞腹一圈測(cè)腰圍；經(jīng)臀部最隆起部位測(cè)臀圍；囑受試者安靜休息5 min，測(cè)量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。計(jì)算體重指數(shù)(BMI)：體重(kg)/身高(m2)。采集空腹靜脈血5 mL，用全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7180，日本)檢測(cè)空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)。電化學(xué)發(fā)光法(E170，羅氏)檢測(cè)空腹胰島素(FINS)水平。全血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和淋巴細(xì)胞百分比。根據(jù)空腹血糖及空腹胰島素水平，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)[7]：HOMA-IR=(FINS × FBG)/22.5，胰島素分泌指數(shù)HOMA-β=FINS ×20/(FBG -3.5)，內(nèi)臟脂肪指數(shù)(visceral adiposity index，VAI)計(jì)算方法如下[8]：

1.2.2 ELISA檢測(cè)血清sCD163水平

用促凝采血管采集研究對(duì)象外周靜脈血3 mL，靜止30 min，2000 r/min離心5 min，取上清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定(美國(guó)BIO-Rad檢測(cè)儀)血清sCD163水平(試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iNKT細(xì)胞頻率

用EDTA抗凝管采集研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，加入等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，緩慢加于Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液液面上，室溫下2000 r/min轉(zhuǎn)速離心25 min，不同細(xì)胞分層為(從上到下)：血漿層、灰白色淋巴細(xì)胞層、透明分離液層和紅細(xì)胞粒細(xì)胞層，用吸管小心吸取灰白色淋巴細(xì)胞層，移入另一試管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液，1000 r/min離心10 min，洗滌2次，棄上清，加入50 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，獲得外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)，加入CD3-PerCP抗體和Vα24-Jα18-FITC抗體(eBioscience,San Diego,USA)，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸鹽緩沖液洗滌1次，加入流式緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀 (Partec,Nuremberg,Germany) 檢測(cè)，CD3和 Vα24-Jα18雙陽(yáng)性區(qū)即為iNKT細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)因子

將PBMC接種于96孔板，加入PMA(1∶100)和ION(1∶20)于5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h激活細(xì)胞，加入BFA(1∶10)繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管，加入磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞1次，1000 r/min離心10 min，以50 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入CD3-PerCP抗體和Vα24-Jα18-FITC抗體對(duì)細(xì)胞表面染色，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸鹽緩沖液洗滌1次，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入PFA固定20 min，加入破膜劑1 mL，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入染色緩沖液50 μL重懸細(xì)胞，加入IL-4-APC抗體和IFN-γ-PE抗體，4 ℃避光孵育20 min，加入磷酸鹽緩沖液洗滌1次，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入流式緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

各組性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；總MS組BMI、WC、SBP、DBP均高于對(duì)照組(P<0.05)；MS-1組BMI、WC、SBP、DBP高于MS-2組和對(duì)照組(P<0.05)，MS-2組SBP高于對(duì)照組(P<0.05)，(表1)。

分組例數(shù)男/女年齡/歲BMI/(kg·m-2)WC/cmSBP/mmHgDBP/mmHg總MS組8043/3755.2±9.226.3±3.693.3±11.2132±1181±8MS-1組4321/2254.2±8.728.7±3.499.9±10.5135±1282±9MS-2組3722/1556.2±9.923.5±1.2#86.1±5.6#130±9#80±7#對(duì)照組6032/2852.7±9.523.6±2.2?#84.3±5.7?# 125±7?#￥76±7?#

注：與總MS組比較，*P<0.05；與MS-1組比較，#P<0.05；與MS-2組比較，￥P<0.05

2.2 各組生化指標(biāo)比較

總MS組、MS-1組、MS-2組TG、TC、FBG、FINS均高于對(duì)照組(P<0.05)；總MS組、MS-1組LDL-C高于對(duì)照組(P<0.05)；MS-1組TG、FBG、FINS高于MS-2組(P<0.05)；總MS組、MS-1組、MS-2組HDL-C均低于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 各組生化指標(biāo)比較

分組TG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)FBG/(mmol·L-1)FINS/(pmol·L-1)總MS組2.0±0.85.4±1.33.1±1.01.0±0.38.0±2.89.0 (6.9,11.8)MS-1組2.3±0.95.5±1.23.3±0.90.9±0.28.5±2.99.4 (8.1,13.7)MS-2組1.5±0.4#5.2±1.53.0±1.01.1±0.37.3±2.5#8.3 (6.6,10.3)#對(duì)照組1.1±0.3?#￥4.6±0.8?#￥2.7±0.6?#1.4±0.3?#￥5.3±0.9?￥6.3 (5.3,8.4)?#￥

注：與總MS組比較，*P<0.05；與MS-1組比較，#P<0.05；與MS-2組比較，￥P<0.05

2.3 各組sCD163、HOMA-IR、HOMA-β及VAI的比較

總MS組、MS-1組、MS-2組血清sCD163水平、HOMA-IR、HOMA-β、VAI值均高于對(duì)照組(P<0.05)；MS-1組血清sCD163水平、HOMA-IR、VAI值均高于MS-2組(P<0.05)；而MS-1組HOMA-β與MS-2組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 各組sCD163、HOMA-IR、HOMA-β及VAI的比較

分組sCD163/(ng·mL-1)HOMA-IRHOMA-βVAI總MS組260.2±56.93.3±1.466.8±53.53.4±1.8MS-1組308.4±23.83.8±1.563.3±44.14.2±1.8MS-2組202.3±21.2#2.7±1.1#70.8 ±63.12.3±0.9#對(duì)照組134.7±52.7?#￥1.6±0.6?#￥97.9±59.3?#￥1.3±0.6?#￥

注：與總MS組比較，*P<0.05；與MS-1組比較，#P<0.05；與MS-2組比較，￥P<0.05

2.4 各組外周血iNKT細(xì)胞頻率及其分泌功能的比較

總MS組、MS-1組、MS-2組及對(duì)照組外周血WBC計(jì)數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),具有可比性。各組外周血WBC計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。MS-1組iNKT細(xì)胞頻率在0.01%～0.78%之間，MS-2組iNKT細(xì)胞頻率在0.06%～0.91%之間，對(duì)照組iNKT細(xì)胞頻率在0.11%-1.05%之間。各MS組iNKT細(xì)胞頻率均低于對(duì)照組(P<0.05)，MS-1組低于MS-2組(P<0.05)；各MS組IFN-γ+iNKT比例均高于對(duì)照組(P<0.05)，MS-1組高于MS-2組(P<0.05)；各MS組IL-4+iNKT比例均低于對(duì)照組(P<0.05)，MS-1組低于MS-2組(P<0.05)；IFN-γ+iNKT/IL-4+iNKT比值比較，各MS組均高于對(duì)照組(P<0.05)，MS-1組和MS-2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組外周血iNKT細(xì)胞頻率及其分泌功能的比較

分組iNKT細(xì)胞頻率/%IFN-γ+iNKT比例/%IL-4+iNKT比例/%IFN-γ+iNKT/IL-4+iNKTWBC(×109)淋巴細(xì)胞比例/%總MS組0.38±0.2551.9±12.720.1±9.33.3±1.96.0±1.531.2±3.7MS-1組0.31±0.2255.3±11.9 18.8±8.03.5±1.85.9±1.430.7±3.6MS-2組0.45±0.28#46.7±12.5# 22.0±10.8#3.0±2.06.3±1.631.6±3.8對(duì)照組0.72±0.29?#￥37.8±13.8?#￥29.1±13.1?#￥1.7±1.5?#￥5.7±1.029.7±4.7

注：與總MS組比較，*P<0.05；與MS-1組比較，#P<0.05；與MS-2組比較，￥P<0.05

2.5 不同性別MS患者外周血iNKT細(xì)胞頻率及其分泌功能的比較

男性、女性MS患者外周血iNKT細(xì)胞頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。iNKT細(xì)胞分泌功能比較，兩組IFN-γ+iNKT細(xì)胞、兩組IL-4+iNKT細(xì)胞的比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。并且外周血WBC計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表5)。

表5 不同性別MS患者外周血iNKT細(xì)胞頻率及其分泌功能的比較

性別iNKT細(xì)胞頻率/%IFN-γ+iNKT比例/%IL-4+iNKT比例/%WBC(×109)淋巴細(xì)胞比例/% 男性0.31±0.2053.4±12.7 20.6±9.26.1±1.731.1±3.8 女性0.28±0.21 53.0±11.4 19.1±9.8 5.9±1.230.2±3.6

2.6 外周血iNKT細(xì)胞頻率及分泌功能的相關(guān)性分析

為分析外周血iNKT細(xì)胞頻率及分泌功能與各個(gè)臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性，我們分別以iNKT細(xì)胞頻率、IFN-γ+iNKT細(xì)胞比例、IL-4+iNKT細(xì)胞比例為因變量，以WC、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-β、sCD163、VAI為自變量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，iNKT細(xì)胞頻率與WC、BMI、TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與HDL-C呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；IFN-γ+iNKT細(xì)胞比例與WC、BMI、TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與HDL-C、HOMA-β呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；IL-4+iNKT細(xì)胞比例與WC、BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(表6)。

表6 外周血iNKT細(xì)胞頻率及分泌功能與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.7 MS危險(xiǎn)因素的Logistic 回歸分析

用條件前進(jìn)法構(gòu)建MS危險(xiǎn)因素的logistic回歸模型，將iNKT細(xì)胞頻率、IFN-γ+iNKT 比例、IL-4+iNKT比例、sCD163、HOMA-IR、HOMA-β、VAI作為協(xié)變量納入模型，因WC、BMI、TG、HDL-C、FBG、FINS與HOMA-IR、HOMA-β、VAI存在共線性關(guān)系，故未納入分析。結(jié)果顯示，iNKT細(xì)胞頻率、HOMA-IR、VAI進(jìn)入回歸方程(P<0.05)(表7)。

表7 MS危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

3 討論

MS也被稱(chēng)之為X綜合征是多個(gè)代謝異常在個(gè)體聚集的現(xiàn)象，大大增加心血管疾病、糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[9]。目前MS的發(fā)病正在呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，而MS確切機(jī)制尚未完全清楚。最新的觀點(diǎn)認(rèn)為，MS與其下游的ASCVD、糖尿病一樣都是炎癥性疾病[1-2]。

肥胖與MS的發(fā)病過(guò)程的密切相關(guān)。脂肪組織按照其分布不同，可分為內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪。目前臨床上評(píng)價(jià)肥胖的常用參數(shù)如：腰圍、腰臀比、BMI等在評(píng)估脂肪的分布和含量方面存在一定的局限性。VAI是評(píng)估內(nèi)臟脂肪的新型工具，其計(jì)算綜合了腰圍、體重指數(shù)、TG、HDL-C等體脂和代謝因素，且兼顧了性別差異，與磁共振檢查計(jì)算的內(nèi)臟脂肪含量吻合度高，能夠準(zhǔn)確反映內(nèi)臟脂肪蓄積情況[10]。已有研究證實(shí)，內(nèi)臟脂肪細(xì)胞膜上腎上腺受體表達(dá)較高，胰島素受體底物蛋白-1的表達(dá)下降，使得游離脂肪酸升高，干擾胰島素信號(hào)通路，激活組織炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂，而皮下脂肪沒(méi)有這種作用[11]。因此，內(nèi)臟脂肪過(guò)度蓄積是啟動(dòng)MS的重要原因。本研究中，正常體重和超重/肥胖的MS患者均表現(xiàn)為VAI升高，提示內(nèi)臟脂肪蓄積是MS患者的重要特征；而超重/肥胖的MS患者VAI升高更加明顯，其代謝紊亂、胰島素抵抗也更嚴(yán)重。臨床上大約20%的正常體重人群存在代謝紊亂，稱(chēng)之為“正常體重代謝性肥胖(metabolically obese but normal weight，MONW)”，其發(fā)生與內(nèi)臟脂肪蓄積有關(guān)。

iNKT細(xì)胞是一類(lèi)特殊的T淋巴細(xì)胞亞群，它既表達(dá)自然殺傷細(xì)胞的表面標(biāo)志，又表達(dá)T細(xì)胞受體。iNKT細(xì)胞可識(shí)別由非多態(tài)性MHC-I類(lèi)抗原呈遞分子CD1d呈遞的脂質(zhì)分子[12]。激活的iNKT細(xì)胞的能夠快速分泌多種細(xì)胞因子，包括抗炎因子(如IL-4、IL-10)和促炎因子(如IFN-γ)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。iNKT細(xì)胞占人外周血淋巴細(xì)胞的1%左右[4]，使用不同的抗體檢測(cè)結(jié)果略有差異。本研究使用CD3和Vα24-Jα18抗體標(biāo)記外周血iNKT細(xì)胞，測(cè)得其頻率范圍在0.01%～1.05%之間，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)之間存在“對(duì)話”，兩者在功能上相互依賴(lài)，保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)兩者的平衡被打破時(shí)，即導(dǎo)致“免疫代謝紊亂(immunometabolic disorders)”。Huh等[13]研究證實(shí)，生理狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞能夠直接激活iNKT細(xì)胞，后者通過(guò)促進(jìn)IL-4等細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)脂肪組織內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)。Lynch等[14]研究顯示，高脂喂養(yǎng)iNKT細(xì)胞缺失的小鼠，更容易誘導(dǎo)肥胖、脂肪肝、胰島素抵抗和高血糖等代謝紊亂；給肥胖小鼠輸注iNKT細(xì)胞，能夠減輕體重、改善糖脂代謝、增加胰島素敏感性。本研究中，MS患者外周血iNKT 細(xì)胞頻率明顯下降，IFN-γ+iNKT細(xì)胞比例升高，IL-4+iNKT細(xì)胞比例下降，且iNKT細(xì)胞頻率與TG、FBG、FINS、HOMA-IR、sCD163、VAI等代謝因素呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示MS患者不僅iNKT細(xì)胞數(shù)目減少，而且其功能也發(fā)生了改變，導(dǎo)致機(jī)體的免疫代謝穩(wěn)態(tài)被打破，可能是誘發(fā)MS的重要原因。

動(dòng)物研究證實(shí)，瘦的個(gè)體，iNKT細(xì)胞分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，維持脂肪組織代謝狀態(tài)的穩(wěn)定；肥胖過(guò)程中，iNKT細(xì)胞比例下降，脂肪組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞活化，促炎因子如IFN-γ、TNF-α釋放，誘發(fā)局部慢性炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)生[5]。sCD163是反映巨噬細(xì)胞活化的特異性標(biāo)志[15]。本研究iNKT細(xì)胞頻率與sCD163、HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，提示MS患者iNKT細(xì)胞的下降導(dǎo)致了脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。各種炎癥因子的釋放可干擾胰島素信號(hào)通路，造成胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。Logistic回歸分析進(jìn)一步證實(shí)，iNKT細(xì)胞是MS的保護(hù)性因素(OR=0.055)，而內(nèi)臟脂肪的增加和胰島素抵抗是MS的致病因素，提示MS是免疫代謝紊亂共同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究證實(shí)MS患者表現(xiàn)為不同程度的內(nèi)臟脂肪蓄積，MS患者 iNKT細(xì)胞頻率下降，功能發(fā)生改變，與內(nèi)臟脂肪指數(shù)密切相關(guān)。人體的免疫和代謝兩大系統(tǒng)相互制約、相互影響，很難說(shuō)清孰因孰果，其中的具體機(jī)制還需要開(kāi)展大量的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)行探索。