李明奇，王小鳳，郭嘉，趙天藝，劉航，張樊，吳長(zhǎng)新，張輝

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000)

布魯菌屬α-2變形桿菌家族致病細(xì)菌[1]，胞內(nèi)寄生和繁殖為該菌主要的毒力特征[2]。主要寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)[3]，人畜共患，是一種傳播途徑廣、寄生宿主多的傳染性疾病，在世界很多國(guó)家和地區(qū)廣泛流行[4]。布魯菌的致病機(jī)制還不完全清楚，研究其致病毒力因子的生物學(xué)功能對(duì)揭示布魯菌的致病機(jī)理具有重要意義。布魯菌毒力因子主要有IV型分泌系統(tǒng)(T4SS)[5]、脂多糖(LPS)、外膜蛋白和Bvr R/BvrS雙組分系統(tǒng)。外膜系統(tǒng)是布魯菌重要的毒力因子，獨(dú)特的外膜結(jié)構(gòu)可抵抗多種宿主細(xì)胞的殺滅作用，布魯菌外膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)主要由磷脂、鳥氨酸脂質(zhì)、脂蛋白和非典型脂多糖(LPS)組成。布魯菌的LPS不具有經(jīng)典的結(jié)構(gòu)特征，布魯菌毒力作用主要與其胞內(nèi)生存和繁殖力有關(guān)[6]。DK63_426基因編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，參與布魯菌LPS的生物合成。本研究通過構(gòu)建DK63_426基因缺失突變株，以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對(duì)象，分析其生長(zhǎng)特點(diǎn)及在細(xì)胞中的存活能力，為進(jìn)一步揭示布魯菌胞內(nèi)感染機(jī)制的奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、血清、細(xì)胞和載體

布魯菌16 M、S2株，E.coliDH5α，小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7均由新疆地方與民族高發(fā)病省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體(TaKaRa)，pUC19 K質(zhì)粒由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

布魯菌培養(yǎng)基(SIGMA)；LB培養(yǎng)基(OXOID)；氨芐霉素、卡那霉素(MERK)；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒；DNA Marker、2×Es Taq Master mix(TaKaRa)；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D)；細(xì)胞培養(yǎng)液、曲拉通(Solarbio)。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根據(jù)Genebank中登錄的Kan基因和布魯菌16 M的DK63_426基因上下游同源臂基因，使用 Primer 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)Kan基因上下游引物和DK63_426同源臂基因上下游引物(表1)由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2DK63_426基因缺失突變株載體的構(gòu)建

布魯菌16 M 85 ℃滅活60 min產(chǎn)物為模板，以DK63_426-N-F、DK63_426-N-R為引物擴(kuò)增上游同源臂。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，66 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)數(shù)為35個(gè)，72 ℃總延伸7 min，最后4 ℃保存；以DK63_426-C-F、DK63_426-C-R為引物擴(kuò)增下游同源臂。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，65 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，最后4 ℃保存；以含有Kan抗性的PUC19 K質(zhì)粒為模板，以Kan-F、Kan-R為引物擴(kuò)增Kan基因。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，65 ℃退火35 s，72 ℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min，最后4 ℃保存。各產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，含有目的基因的膠塊根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取。

將Kan基因和DK63_426基因上下游同源臂3段基因的PCR產(chǎn)物按照1∶1∶1的比例混合作為融合PCR的模板，經(jīng)兩輪PCR反應(yīng)：第一輪PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，63.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min，最后4 ℃保存；產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，DK63_426-N-F和DK63_426-C-R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min，最后4 ℃保存。反應(yīng)完成后，PCR 產(chǎn)物在經(jīng)1% 凝膠中電泳檢測(cè)，含有目的基因的膠塊根據(jù)瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，將融合片段與pMD19-T載體質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建pMD19-T- DK63_426-Kan重組質(zhì)粒。交由上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.3DK63_426基因缺失突變株的構(gòu)建

pMD19-T- DK63_426-Kan重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到布魯菌16 M感受態(tài)細(xì)胞中，并且涂平板于具有Kan抗性的布魯菌固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，在培養(yǎng)基中選取單個(gè)菌落并置于新鮮的具有Kan抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃搖菌24 h后取100 μL菌液，85 ℃滅活30 min后作為模板，用外部檢測(cè)引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和內(nèi)部檢測(cè)引物(DK63_426-F、DK63_426-R)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以16 M親本株作為對(duì)照進(jìn)行鑒定，對(duì)于驗(yàn)證成功的重組突變株命名為16 MΔDK63_426。

1.2.4 16 MΔDK63_426遺傳穩(wěn)定性的分析

將16 MΔDK63_426菌液在含有Kan抗性的布魯菌固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，選取單克隆菌落傳15代，85 ℃滅活，并以此作為鑒定缺失株的 PCR 模板，用外部檢測(cè)引物和內(nèi)部檢測(cè)引物對(duì)布魯菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以16 M親本株作為對(duì)照進(jìn)行鑒定。產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠檢測(cè)其結(jié)果，同時(shí)將外部引物獲得的片段經(jīng)回收后，送上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 布魯菌 16 MΔDK63_426及其親本株生長(zhǎng)特性檢測(cè)

分別挑取布魯菌16 MΔDK63_426、16 M和S2 單克隆菌落于布魯菌液培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm≈0.8，用新鮮的布魯菌液體培養(yǎng)基調(diào)整到OD600nm≈0.1繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔2 h收取菌液，滅活檢測(cè)OD600nm值，直至各菌株培養(yǎng)至平臺(tái)期，繪制布魯氏菌16 MΔDK63_426、16 M和S2的生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.6 布魯菌16 MΔDK63_426胞內(nèi)生存試驗(yàn)

我們將長(zhǎng)勢(shì)良好的RAW264.7傳到六孔細(xì)胞板中，每孔106個(gè)，分別使用生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 16 MΔDK63_426和親本株按照侵染復(fù)數(shù)(MOI)100∶1侵染上述細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗4次，轉(zhuǎn)接含慶大霉素培養(yǎng)基，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，待4、8、12、24 h 時(shí)棄去培養(yǎng)基，PBS清洗0.1%曲拉通裂解細(xì)胞，涂于布魯菌固體培養(yǎng)基，進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞因子的檢測(cè)

將16 MΔDK63_426、16 M分別侵染RAW264.7細(xì)胞，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，待4、8、12、24 h時(shí)收集細(xì)胞清液，按照IL-6，TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)細(xì)胞因子釋放量。

2 結(jié)果

2.1 DK63_426基因缺失突變株載體的構(gòu)建

2.1.1DK63_426基因同源臂及Kan基因擴(kuò)增

以布魯菌16 M為模板，PCR擴(kuò)增DK63_426基因N端和C端的同源臂序列，獲得與預(yù)期相符目的條帶(圖1A，泳道1～3為DK63_426基因N端，泳道4～6為陰性對(duì)照，泳道7～11為DK63_426基因C端)；以PUC19 K質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增Kan基因，獲得與預(yù)期相符目的條帶(圖1B)，泳道15為陰性對(duì)照。

圖1 DK63_426基因同源臂及Kan基因擴(kuò)增

2.1.2 融合PCR擴(kuò)增

將獲得的三段目的基因：DK63_426基因上游同源臂基因、Kan抗性基因，用融合PCR技術(shù)進(jìn)行融合擴(kuò)增，結(jié)果顯示融合基因約為 2091 bp(圖2)，泳道7為陰性對(duì)照。

圖2 融合PCR擴(kuò)增

2.1.3 缺失突變株載體的構(gòu)建及鑒定

將融合片段與PMD19-T載體連接，對(duì)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)展出與預(yù)期相符的條帶(圖3)，泳道5為陰性對(duì)照；陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果與目的基因片段一致。說(shuō)明成功構(gòu)建pMD19-T- DK63_426-Kan重組質(zhì)粒。

圖3 缺失突變株載體的構(gòu)建及鑒定

2.2 DK63_426基因缺失突變株的構(gòu)建

用外部檢測(cè)引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和內(nèi)部檢測(cè)引物(DK63_426-F、DK63_426-R)對(duì)電轉(zhuǎn)后的16 M陽(yáng)性單克隆菌株進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示：外部檢測(cè)只有16 MΔDK63_426出現(xiàn)條帶(圖4A)，內(nèi)部檢測(cè)只有親本株出現(xiàn)條帶，沒有回復(fù)突變現(xiàn)象(圖4B)，表明成功構(gòu)建DK63_426基因缺失突變株。

注：1：親本株；2～14：16 MΔDK63_426；15：親本株；16：陰性對(duì)照?qǐng)D4 DK63_426基因缺失突變株的構(gòu)建

2.3 16 MΔDK63_426遺傳穩(wěn)定性的分析

我們利用外部檢測(cè)引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和內(nèi)部檢測(cè)引物(DK63_426-F、DK63_426-R)對(duì)16 MΔDK63_426連續(xù)傳15產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以16 M親本株作為對(duì)照，結(jié)果顯示：外部檢測(cè)只有16 MΔDK63_426出現(xiàn)條帶(圖5A)，內(nèi)部檢測(cè)只有親本株出現(xiàn)條帶，沒有回復(fù)突變現(xiàn)象(圖5B)，16 MΔDK63_426可穩(wěn)定遺傳。

注：1～9：16 MΔDK63_426；10：親本株；11～14：16 MΔDK63_426； 15：親本株；16：陰性對(duì)照?qǐng)D5 16MΔDK63_426遺傳穩(wěn)定性分析

2.4 布魯菌16 MΔDK63_426 及其親本株生長(zhǎng)特性檢測(cè)

通過對(duì)布魯菌16 MΔDK63_426及其親本株的生長(zhǎng)曲線可以看出，布魯菌 16 MΔDK63_426及其親本株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，培養(yǎng)至12 h時(shí)所有菌株都已到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到30 h 到達(dá)細(xì)菌生長(zhǎng)平臺(tái)期(圖6)。

圖6 16M、16 MΔDK63_426和S2生長(zhǎng)曲線

2.5 布魯菌16 MΔDK63_426侵染RAW264.7細(xì)胞 CFU計(jì)數(shù)

布魯菌 16 MΔDK63_426與親本株在侵染RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24 h進(jìn)行收樣培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)可看出布魯菌 16 MΔDK63_426在侵染RAW264.7細(xì)胞12 h胞內(nèi)存活率顯著低于親本株(P<0.01)，到24 h和親本株沒有顯著性差異(圖7)。

圖7 布魯菌16 M和16 MΔDK63_426胞內(nèi)存活能力

2.6 細(xì)胞因子的檢測(cè)

通過ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果顯示：親本株與缺失株組侵染侵染RAW264.7細(xì)胞在4、8、12、24 h細(xì)胞因子IL-6、TNF-α均高于PBS對(duì)照組，在侵染8 h時(shí)IL-6的分泌量缺失株組均顯著低于親本株(P<0.05)；TNF-α的分泌量缺失株組均顯著高于親本株(P<0.05)，在侵染12 h時(shí)IL-6的分泌量缺失株組均極顯著低于親本株(P<0.01)；TNF-α的分泌量缺失株組均極顯著高于親本株(P<0.01)，到 24 h和親本株沒有顯著性差異(圖8、圖9)。

結(jié)果表明16 MΔDK63_426可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌且與親本株有差異。

圖8 IL-6的表達(dá)量

圖9 TNF-α的表達(dá)量

3 討論

布魯菌是革蘭氏陰性菌，其外膜在感染宿主的過程起到關(guān)鍵性作用，外膜的外層結(jié)構(gòu)主要是脂多糖[7]。脂多糖是布魯菌的主要毒力因子、表面抗原，由OPS、核心多糖和具有內(nèi)毒素性質(zhì)的類脂A三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[8]，在布魯菌中的生物合成過程如下：布魯菌以葡萄糖為原料，轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌麉⑴c合成的糖分子，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)隨著糖基轉(zhuǎn)移酶的連續(xù)酸化，將各類糖基不斷加到類脂A骨架上，直到2個(gè)KDO殘基合成到類脂A中，然后將合成好的類脂A轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)；OPS以獨(dú)立形式在膜內(nèi)合成，連接類脂A受體糖上，通過ABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)；在細(xì)胞周質(zhì)OPS由特定的連接酶催化綁定到類脂A上[9]。DK63_426基因編碼一種糖基轉(zhuǎn)移酶，屬于RfaB家族，在大腸桿菌有關(guān)研究報(bào)道參與LPS的合成[10]。研究該基因的生物學(xué)功能將會(huì)為揭示布魯菌LPS的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

DK63_426基因作為參與合成LPS的基因，可以影響細(xì)菌的生長(zhǎng)、胞內(nèi)生存及炎癥反應(yīng)的能力[11]。病原體侵害機(jī)體時(shí)會(huì)誘發(fā)體液免疫與細(xì)胞免疫，引起相關(guān)介質(zhì)與細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥對(duì)機(jī)體造成影響[12]。布魯菌侵染宿主細(xì)胞后，會(huì)引起先天性免疫和獲得性免疫，而獲得性免疫主要受一系列細(xì)胞因子影響，主要包括：IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MIP-1α等[13]，其中TNF- α可誘發(fā)代謝變化，可促進(jìn)相關(guān)炎癥介質(zhì)生成[14-15]，IL-6來(lái)源巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，是一種炎癥遞質(zhì)[16]，IL-6和TNF-α表達(dá)量是重要的致炎指標(biāo)。本文中DK63_426基因缺失后TNF-α的表達(dá)量顯著下降，IL-6表達(dá)量有所升高，同為炎癥炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子在該基因缺失后存在不同的表現(xiàn)形式，這種機(jī)制還要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的驗(yàn)證。

由于布魯菌沒有質(zhì)粒，外源的質(zhì)粒大多不能在其中復(fù)制，很多質(zhì)?？梢宰兂勺詺⑤d體來(lái)完成布魯菌基因缺失突變株的構(gòu)建[17]，不同于傳統(tǒng)的構(gòu)建缺失突變株的方法，本研究利用同源重組方法，采用抗性基因交換的方式規(guī)避了質(zhì)粒整合所產(chǎn)生的一系列問題，并且抗性基因的存在直接使構(gòu)建的缺失株具備篩選標(biāo)記，能夠很容易地獲得目的突變株[18-19]，可提高研究目的基因的效率。本研究采用同源重組抗性替換方法構(gòu)建布魯菌缺失株遺傳性穩(wěn)定，說(shuō)明采用抗性基因交換的方式效率高穩(wěn)定性好。進(jìn)一步做生長(zhǎng)特性檢測(cè)與胞內(nèi)生存試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失株與親本株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但胞內(nèi)存活率顯著低于親本株，表明該基因突變后布魯菌可能無(wú)法形成完整的LPS結(jié)構(gòu)，改變布魯菌維持宿主細(xì)胞的存活能力。

本研究采用同源重組方法、利用抗性基因交換的方式成功構(gòu)建了16 MΔDK63_426，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究16 MΔDK63_426與親本株相比其生長(zhǎng)特性、存活能力、促炎作用，證實(shí)DK63_426基因的缺失降低了布魯菌的胞內(nèi)存活能力，影響相關(guān)炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，這與DK63_426基因功能息息相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了LPS與致炎作用的關(guān)系，為布魯菌感染機(jī)制的研究和新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。