王曉路，翟曼君，解一凡，張虎軍，李青峰，趙宗勝*

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子，832003；2石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子，832003)

雞在養(yǎng)殖生產(chǎn)中有著重要地位，生長(zhǎng)發(fā)育性狀和經(jīng)濟(jì)性狀受著性別的影響，不同性別的雞在生產(chǎn)性能有著顯著的差異。在生產(chǎn)過(guò)程中根據(jù)不同生產(chǎn)需要我們需要不同性別的雞，如肉雞生產(chǎn)我們希望得到的雛雞都是公雞，但在蛋雞生產(chǎn)過(guò)程中，希望得到的雛雞都是母雞。因此人們對(duì)性別分化進(jìn)行了研究。性別這一質(zhì)量性狀受到遺傳因素和環(huán)境條件的影響，所以可以通過(guò)這兩方面來(lái)調(diào)控性別分化。與哺乳動(dòng)物不同的是，在禽類中至今尚未發(fā)現(xiàn)與性別分化相關(guān)聯(lián)的核心調(diào)控基因。脊椎動(dòng)物性腺的分化過(guò)程是大致相同的，所以性別的決定在其遺傳的途徑上也是相對(duì)統(tǒng)一的，只是在有些的主要的調(diào)控點(diǎn)上有些差異。已經(jīng)有學(xué)者對(duì)脊椎動(dòng)物中與決定性別聯(lián)系有的基因的表達(dá)情況在雞胚中得到了證實(shí)[1]。

數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling，DGE)是利用高通量測(cè)序、高性能計(jì)算分析的技術(shù)[2]。近年來(lái)，伴隨著高通量技術(shù)的廣泛應(yīng)用，DGE技術(shù)也不斷的被使用，這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。目前，有研究人員對(duì)中華鱉面對(duì)冷脅迫的反應(yīng)途徑和生物學(xué)功能進(jìn)行了研究[3]。通過(guò)對(duì)小鼠心臟組織進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，進(jìn)一步闡明了哺乳動(dòng)物的心臟具有可測(cè)量的更新能力過(guò)程的機(jī)制，采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，檢測(cè)到小鼠的心臟在不同關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的全基因表達(dá)譜，利用此技術(shù)也鑒定了家蠶潛在母體基因[4]。

本試驗(yàn)擬用DGE技術(shù)，試圖去建立有關(guān)雌雄雞胚胎發(fā)育至第三天的DGE文庫(kù)。從而篩選出不同組間的差異表達(dá)基因，以便進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，重點(diǎn)查找和分析與雞胚胎性別分化相關(guān)的差異表達(dá)基因，為研究雞胚胎性別分化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購(gòu)自于新疆中盛峪口禽業(yè)有限公司，品種為京紅1號(hào)。在孵化機(jī)中進(jìn)行同批次的孵化種蛋，并把溫度調(diào)控在37.2 ℃～38.5 ℃，濕度控制在54%～70%。采集孵化第三天發(fā)育正常的胚胎，放入1.5 mL無(wú)酶離心管中，迅速置于液氮中，于-80 ℃保存待用。

TRizol試劑(購(gòu)自于TRizol?Reagent，Invitrogen)；DNA提取試劑盒、Marker1(均購(gòu)自于北京天根生物工程)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.2 胚胎采集與性別鑒定

隨機(jī)采取3日齡(72 h)的雞胚30枚，采集前照蛋，確保樣品為受精蛋。采集的胚胎分為兩部分，前部用于DNA提取，后部放入無(wú)酶管，放入-80 ℃冰箱中保存。

CHD(chromobox-helicase-DNAbinding)基因2550F/2718R，設(shè)計(jì)引物鑒定性別[5]，CHD引物：F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′；R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′；進(jìn)行PCR擴(kuò)增并用1.5%的凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。雄性和雌性胚胎組織分別擴(kuò)增出1條和 2條片段。

1.3 DGE文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

采集孵化72 h相同性別的雞胚胎6枚，作為一份混合樣，各自有3個(gè)重復(fù)。提取雞胚胎中總的RNA并用凝膠鑒定總RNA的含量、純度和完整性。由華大基因公司生物分析儀對(duì)樣品先進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)量合格后進(jìn)行測(cè)序。RNA質(zhì)量合格后，取每個(gè)胚胎總RNA，用磁珠富集總mRNA并反轉(zhuǎn)成cDNA。加PrimerGX1和PrimerGX2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用6%的PAGE擴(kuò)增出來(lái)樣本條帶，經(jīng)膠回收純化后由華大基因測(cè)序。

1.4 DGE數(shù)據(jù)分析

首先，篩選雞胚中差異表達(dá)的基因以及模式聚類分析，然后進(jìn)行Gene Ontology功能顯著性富集，最后 KEGG Pathway顯著性富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

1.5.1 引物序列設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中雞的mRNA序列HINT1Z(NM_204689.1)，SOX9的mRNA序列(NM_204281.1)，雞RSPO1的mRNA序(NM_001318444.1)，雞DMRT1的mRNA序列(NM_001101831.1)，LHX9序列(NM_205426.1)和GAPDH(NM_204305.1)，PCR引物見(jiàn)表1，引物合成由上海生工完成。

表1 各基因熒光定量引物

1.5.2 RNA提取及cDNA合成與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取-80 ℃保存的第三天胚胎組織樣，提取總的RNA并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，放-20 ℃?zhèn)溆?。最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR；所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，以減少由于實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程、環(huán)境等引起的不可避免的誤差。雞的GAPDH作為內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用2-△△CT的方法計(jì)算基因相對(duì)的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎采集與性別鑒定

雞孵化72 h的胚胎形態(tài)如圖1所示，采樣收集與此具有相似的大小及形態(tài)的胚胎。

圖1 雞胚胎發(fā)育72 h形態(tài)

用凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，其條帶清晰無(wú)拖尾；用分光光度計(jì)測(cè)核酸濃度，質(zhì)量合格，-20 ℃保存用做后續(xù)試驗(yàn)。用CHD基因PCR，泳道1-4擴(kuò)出2條帶是雌雞；5-11擴(kuò)出1條帶是雄雞(圖2)。

注：M：DNAmarkerⅠ(600 bp)，1-4：雌性， 5-11：雄性，12：陰性對(duì)照?qǐng)D2 PCR擴(kuò)增鑒定早期胚胎性別

2.2 DGE測(cè)序數(shù)據(jù)的評(píng)估

得到的2個(gè)DGE文庫(kù)：胚胎發(fā)育到72 h(21期)的雌性胚胎(CF)和雄性胚胎(CM)。經(jīng)測(cè)序后的雌雞、雄雞獲得Clean Reads數(shù)分別為3663147、3622515，分別占原始數(shù)據(jù)3693492、3650026的99.18%、99.25%。分別有2840108、2817776條Clean Reads數(shù)可以比對(duì)到參考基因序列中，分別占總Clean Reads數(shù)的77.53%、77.79%。

2.3 差異表達(dá)基因篩選

差異基因的表達(dá)圖如圖3所示，利用DGE篩選出它們之間表達(dá)差異的標(biāo)簽，紅色代表上調(diào)，綠色代表下調(diào)；雌性雞和雄性雞之間的差異表達(dá)基因的個(gè)數(shù)是66個(gè)，上調(diào)的是41個(gè)基因，下調(diào)的是25個(gè)基因(圖4)。

圖3 差異基因表達(dá)圖

圖4 雄性(CF)vs雌性(CM)差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

2.4 差異基因表達(dá)模式聚類分析

功能相似的基因往往會(huì)有相類似表達(dá)模式。每行是一個(gè)基因，不同表達(dá)變化的倍數(shù)或著表達(dá)量用不同的顏色表示。差異基因聚類：紅色表達(dá)上調(diào)，綠色表達(dá)下調(diào)；對(duì)于樣品的聚類：顏色越深則表示其表達(dá)量越高(圖5)。

圖5 差異表達(dá)基因等級(jí)聚類圖

2.5 Gene Ontology功能顯著性富集分析

模式聚類分析，是一種表達(dá)模式即幫助科研人員觀察到有某個(gè)功能的所有的差異基因表達(dá)。GO 功能分為3大類即分子功能、細(xì)胞組分以及生物過(guò)程。這3個(gè)大類別又被詳細(xì)的劃分為62個(gè)亞類，例如代謝過(guò)程、生化過(guò)程、免疫防御生長(zhǎng)與發(fā)育等過(guò)程。雌性雞與雄性雞，通過(guò)功能注釋，其中生物過(guò)程共獲得與性別分化相關(guān)基因5個(gè)：HINT1Z、SOX9、RSPO1、DMRTI基因和LHX9基因(圖6)。

圖6 CF與CM差異表達(dá)基因分子功能顯著富集的GOterms

2.6 KEGG Pathway顯著性富集分析

Pathway分析利用KEGG生物通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集度分析，對(duì)比獲得的差異表達(dá)基因經(jīng)過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，能夠準(zhǔn)確定位到對(duì)應(yīng)的Pathway條目中，經(jīng)過(guò)超幾何的檢驗(yàn)，得到差異基因顯著富集20條。包含p53、 Wnt以及TGF-β等參與生殖、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路。部分結(jié)果展示如表2所示。

表2 差異表達(dá)基因顯著富集的部分Pathway

注：表中上標(biāo)均表示次方

2.7 熒光定量

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)選5個(gè)差異表達(dá)基HINT1Z、SOX9、RSPO1、DMRTI基因和LHX9基因，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)分析，P<0.05為顯著*，P<0.01為極顯著**(圖7)。HINT1Z基因在雄雞中比在雌雞中的表達(dá)量較高，在雌雄雞中表達(dá)差異不顯著；RSPO1基因表達(dá)雌雞比雄雞中高；SOX9基因表達(dá)量雄雞高于雌雞且差異極顯著；DMRT1基因在雄雞中的表達(dá)量高于雌雞且差異極顯著；LHX9雄雞中的表達(dá)量較雌雞中高但差異不顯著。各基因的相對(duì)表達(dá)量均與DGE文庫(kù)中上調(diào)與下調(diào)的結(jié)果一致(圖8)。這些基因的缺失或著突變會(huì)引起個(gè)體性腺發(fā)育異?；蛑l(fā)生性反轉(zhuǎn)，在鳥類的性別分化過(guò)程中已被證明很重要，部分基因在常或性染色體上。這些基因不會(huì)單獨(dú)發(fā)揮功能需要多個(gè)基因參與來(lái)共同調(diào)控性別分化。

注：*表示P<0.05,**表示P<0.01圖7 差異基因相對(duì)表達(dá)量

圖8 差異表達(dá)基因的q RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果和 DGE文庫(kù)測(cè)序結(jié)果的差異倍數(shù)比較

3 討論

雞種蛋孵化第3天，胚胎中腎腹內(nèi)側(cè)表面可見(jiàn)原始性腺，接著性腺會(huì)開始分化為雌雄雞，本試驗(yàn)選取72 h的雞胚為試驗(yàn)對(duì)象為了探究在胚胎分化時(shí)刻與相別分化相關(guān)基因的表達(dá)情況來(lái)探究在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中與性別分化相關(guān)的決定基因。孵化3 d雌、雄雞進(jìn)行DGE分析，共計(jì)獲得大約7 M的數(shù)據(jù)量，兩個(gè)樣品的cleanreads都大于99%，表示測(cè)序質(zhì)量較高。將兩組cleanreads數(shù)據(jù)分別與數(shù)據(jù)庫(kù)中參考轉(zhuǎn)錄組比對(duì)，其中有77% 以上序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考轉(zhuǎn)錄組能比對(duì)一致，結(jié)果比較理想，RPKM定量分析，選出樣品間差異基因，GO功能及KEGG，表明差異基因?yàn)榭刂菩苑只嚓P(guān)基因，如RSPO1、SOX9、DMRTI、LHX9基因，在表達(dá)時(shí)間上也與前期研究一致[6-7]。

RSPO1基因，是RSPO家族第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的基因，因?yàn)樗磉_(dá)在胚胎神經(jīng)管頂板且與血小板有相同結(jié)構(gòu)域，所以稱為RSPO1。RSPO1基因在性分化中卵巢發(fā)育扮演著關(guān)鍵角色，本試驗(yàn)表明RSPO1基因表達(dá)雌雞比雄雞中高。雞胚胎生長(zhǎng)至4.5 d，RSPO1基因在雌雞和雄雞胚胎性腺中的表達(dá)不同，到E8.5差異會(huì)變大，RSPO1基因在雄雞性腺中表達(dá)不變，而雌雞性腺中表達(dá)上升[8]。卵巢發(fā)育RSPO1高表達(dá)，RSPO1突變會(huì)引起XX型的病人性反轉(zhuǎn)。WNT信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)物是RSPO1基因，它作用的通路有β-連環(huán)蛋白等[9]。WNT蛋白和RSPO1基因共表達(dá)，且能正向調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白信號(hào)，推斷在WNT通路中能分泌生長(zhǎng)因子。Wnt4能激活β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳遞，是形成正常卵巢必備的。在雞胚胎中，RSPO1雌性上調(diào)，性腺的皮質(zhì)到外髓中RSPO1和WNT4表達(dá)。

具有一個(gè)能編碼約79個(gè)氨基酸的HMG保守序列是SRY相關(guān)促HMG盒基因家族共性，發(fā)現(xiàn)SRY基因后首個(gè)有內(nèi)含子的Sox家族成員是Sox9基因。本試驗(yàn)表明SOX9基因表達(dá)量雄雞高于雌雞且差異極顯著。Sox9基因在雞胚胎孵化E6.5 d到E8.5 d時(shí)在雌性性腺中不表達(dá)，而在雄性中表達(dá)。性分化中哺乳動(dòng)物性反轉(zhuǎn)是由XY胚胎的Sox9基因失活引起。XX胚胎中，Sox9表達(dá)上調(diào)可阻止雌性生殖器發(fā)育來(lái)向雄性發(fā)育[10]。Sox9異位表達(dá)，可使XX胚胎向XY個(gè)體發(fā)育。Sox9突變使性腺發(fā)育失常，XY性別發(fā)育異?；騒X男性性反轉(zhuǎn)，性腺發(fā)育失常占約為30%～40%是由Sox9基因突變引起[11]。雞無(wú)SRY基因，但能表達(dá)Sox9，最新研究表明[12]，Sox9基因單個(gè)遠(yuǎn)端增強(qiáng)子缺失后的性反轉(zhuǎn)，Sox9基因中的增強(qiáng)子13是啟動(dòng)小鼠睪丸發(fā)育所必需的，它的缺失導(dǎo)致XY雌性的Sox9轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)于XX性腺的轉(zhuǎn)錄水平。

鳥類DMRT1基因在Z染色體，其作用遵循劑量機(jī)制，是鳥類中與性別分化相關(guān)的備選調(diào)節(jié)基因。DMRT1是鋅指樣家族的一員，所有物種DMRT1基因有保守DNA結(jié)合域與性別決定有關(guān)，且在性分化中相對(duì)保守的。本研究中DMRT1基因在雄雞中的表達(dá)量高于雌雞且差異極顯著。成人睪丸中表達(dá)DMRT1但卵巢中較少表達(dá)。雄鼠DMRT1基因敲除不會(huì)出現(xiàn)性反轉(zhuǎn)，但其睪丸由于生殖及支持細(xì)胞功能紊亂會(huì)發(fā)育失常。人類性腺發(fā)育失?？捎扇旧w含DMRT1區(qū)段缺失引起。DMRT1基因在雞胚性腺外器官表達(dá)情況被Ayers等[13]首次發(fā)現(xiàn)，它在導(dǎo)管形態(tài)且在兩性雞胚的早期繆勒氏管中也都表達(dá)。雌性雞胚性腺被含外源DMRT1的病毒載體感染，結(jié)果DMRT1在雌性中高表達(dá)且上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)雄性通路，抑制雌性雞性逆轉(zhuǎn)[14]?？傊?，DMRT1是性腺發(fā)育標(biāo)志的關(guān)鍵基因，但它的產(chǎn)物對(duì)性別決定不能直接起作用，有可能是通過(guò)調(diào)控其他的雄性基因，一起作用于性腺。

HINT1Z基因又稱HINTZ基因，可以與目前為止在禽類W性染色體上發(fā)現(xiàn)唯一與性分化有關(guān)的基因HINTW的編碼產(chǎn)物形成二聚體影響雄性發(fā)育。HINT1Z基因在胚胎發(fā)育前期中雄雞發(fā)育較高但是差異不顯著。LHX9(LIM-homeodomain gene9)是保守轉(zhuǎn)錄因子家族Apterous組的一員，LHX9基因?qū)π韵?、四肢、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)器官發(fā)育是必需的，本研究發(fā)現(xiàn)在早期胚胎發(fā)育中LHX9雄雞中的表達(dá)量較雌雞中高但差異不顯著。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)LHX9基因突變的小鼠基因型是雌性或雄性均表現(xiàn)為性腺不育[15]，研究者還發(fā)現(xiàn)LHX9基因有3種亞型，每個(gè)亞型都有獨(dú)特的表達(dá)模式，且只有LHX9a和LHX9c在肢體發(fā)育早期表達(dá)。HINT1Z基因、LHX9基因在禽類上胚胎性腺發(fā)育的研究還有待探索。

4 結(jié)論

通過(guò)成功構(gòu)建了雞孵化第3天的雌性和雄性胚胎DGE文庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出雞早期胚胎發(fā)育中與性別分化相關(guān)的差異表達(dá)基因HINT1Z、RSPO1、SOX9、DMRTI、LHX9基因，為禽類早期胚胎性別分化的研究奠定基礎(chǔ)。