張藝萍,楊秀梅,許 鳳,王麗花,蘇 艷,唐藝蓉,瞿素萍*,吳學(xué)尉

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/云南省花卉工程技術(shù)研究中心/云南省昆明市花卉遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650205;2.云南云科花卉有限公司,云南 昆明 650200;3.云南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,云南 昆明 650200)

寄主植物在受到病原菌侵染以后會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化,其中POD (peroxidase) (過(guò)氧化物酶)、PPO (polyphenol oxidase) (多酚氧化酶)、PAL (phenylalanine ammonia-lyase) (苯丙氨酸解氨酶)、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶是跟寄主植物抗病性緊密相關(guān)的酶類(lèi)。寄主植物在抵抗病原菌的侵染過(guò)程中,抗病性相關(guān)酶起到十分重要的作用,這主要包括酚類(lèi)代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族。POD在寄主植物抗病反應(yīng)中所起的關(guān)鍵作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)POD參與木質(zhì)素的合成[1];有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)水稻在遭受黃單胞病菌侵染后,陽(yáng)離子過(guò)氧化物酶可以在水稻葉肉細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙及木質(zhì)部導(dǎo)管腔內(nèi)累積,致使水稻黃單胞病菌無(wú)法侵染到寄主細(xì)胞內(nèi),因此認(rèn)為這種陽(yáng)離子POD參與木質(zhì)素的合成與寄主植物的抗病性相關(guān)[2]。(2) POD可將寄主植物細(xì)胞內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì),從而增強(qiáng)寄主植物的抗病性;有學(xué)者研究了洋蔥與蔥腐葡萄孢的互作后發(fā)現(xiàn),在蔥腐葡萄孢侵入洋蔥表皮細(xì)胞的部位,酚類(lèi)物質(zhì)含量明顯增多并形成顆粒沉積物,顆粒沉積物的形成與過(guò)氧化物酶的活性增強(qiáng)緊密相關(guān)[3]。(3) POD參與木栓質(zhì)的合成,從而可以加快寄主植物傷口愈合的速度;有研究發(fā)現(xiàn)在番茄組織和馬鈴薯塊莖的過(guò)敏性反應(yīng)中陰離子過(guò)氧化物酶催化合成木栓質(zhì)[4]。(4) POD參與富含羥脯氨酸糖蛋白的合成,從而增強(qiáng)寄主細(xì)胞表面的強(qiáng)度[5]。

PAL參與苯丙烷類(lèi)代謝通路上的第一步反應(yīng),它參與植保素、黃酮、酚類(lèi)物質(zhì)及木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成, PAL與寄主植物的抗病性緊密相關(guān)[6]。有學(xué)者研究了枯萎病尖孢鐮刀菌侵入西瓜幼苗后其葉片和根莖部組織中POD和PAL的活性變化,發(fā)現(xiàn)隨著病原菌的侵入,抗病西瓜品種和感病西瓜品種體內(nèi)POD和PAL兩種酶的活性都有不同程度的增強(qiáng),但抗病西瓜品種的增強(qiáng)幅度比感病西瓜品種顯著提高[7,8]。李捷等[9]研究發(fā)現(xiàn)接種枸杞根腐病菌尖孢鐮刀菌后,抗病的枸杞品種中PAL活性明顯比感病品種的強(qiáng)。周瑜等[10]研究發(fā)現(xiàn)接種糜子黑穗病菌后,感病品種糜子葉片中PAL活性變化幅度明顯大于抗病品種。王紹敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)接種立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)后72 h內(nèi),玉米體內(nèi)的PAL活性呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì),并在72 h時(shí)出現(xiàn)第一個(gè)峰值；隨后PAL活性降低,在144 h時(shí)又呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。

高等植物體內(nèi)PPO是由核編碼的含銅的金屬蛋白酶,位于植物細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)囊體,PPO的底物位于細(xì)胞液泡內(nèi),當(dāng)病原菌侵入寄主植物時(shí),PPO與底物結(jié)合,氧化底物合成醌類(lèi)物質(zhì),多酚及醌類(lèi)物質(zhì)能使病原菌生長(zhǎng)所必需的磷酸化酶和轉(zhuǎn)氨酶的合成受到阻礙,從而限制病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。PPO不但可以參與酚類(lèi)物質(zhì)的氧化,還可以參與木質(zhì)素的合成,木質(zhì)素除了可以增強(qiáng)寄主植物細(xì)胞壁對(duì)抗病原菌的壓力外,還能抑制真菌酶和病原菌所分泌的毒素的進(jìn)一步擴(kuò)散,進(jìn)而可以限制病原菌的侵入。PPO氧化酶活性與抗病性相關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)PPO活性與玉米抗感病害的研究結(jié)果吻合[13]。

本研究主要測(cè)定了百合抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系在接種尖孢鐮刀菌和尖孢鐮刀菌毒素后POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶的活性變化，這將有利于揭示毒素篩選無(wú)性系的生化抗性機(jī)制,從而為該方法提供一定的生化理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 采用正常生長(zhǎng)的感病百合品種‘卡薩布蘭卡’(‘Casa Blanca’)無(wú)性系(以下簡(jiǎn)稱感病無(wú)性系),以及經(jīng)尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型毒素篩選后獲得的‘卡薩布蘭卡’抗病無(wú)性系(以下簡(jiǎn)稱抗病無(wú)性系)作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 病原菌 從感病組織中分離純化后獲得的尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型(F.oxysporumf. sp.lilii),已經(jīng)經(jīng)過(guò)菌絲、孢子形態(tài)及分子鑒定。其菌株一直保存在PDA培養(yǎng)基上。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液及其粗毒素的制備 將馬鈴薯蔗糖瓊膠(PSA)培養(yǎng)基上的尖孢鐮刀菌擴(kuò)大培養(yǎng)后配制成孢子懸浮液(含孢子1×106個(gè)/mL)。無(wú)菌尖孢鐮刀菌毒素粗提液的制備參照臺(tái)蓮梅等[14]的方法進(jìn)行。

1.2.2 樣品處理及制備方法 將感病無(wú)性系和抗病無(wú)性系的生根組培苗置于含無(wú)菌水的試管中,切根后接種尖孢鐮刀菌百合專(zhuān)化型的孢子懸浮液(孢子1×106個(gè)/mL)；同時(shí)取切根后的植株浸于粗毒素中。分別于接種后0、6、12、24、48、72 h取樣,在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶的活性。

1.2.3 防御酶活性的測(cè)定方法 POD、PAL活性的測(cè)定按李合生[15]的方法進(jìn)行。PPO活性的測(cè)定按梁小紅[16]的方法進(jìn)行。β-1,3-葡聚糖酶的提取和活性測(cè)定參照余永廷等[17]的方法進(jìn)行。幾丁質(zhì)酶的提取和活性測(cè)定參照史益敏[18]的方法進(jìn)行。酶活性是以實(shí)驗(yàn)材料的干重DW(g)為單位進(jìn)行計(jì)算的。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)與整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并用插圖功能生成圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系POD活性的變化

如圖1所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系的POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì),但抗病無(wú)性系的POD活性高于感病無(wú)性系,抗病無(wú)性系的POD活性在48 h達(dá)最高；抗病無(wú)性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,POD活性峰值比感病無(wú)性系提高了322.03 U/(g·min)；抗病無(wú)性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,POD活性峰值比感病無(wú)性系提高了244.33 U/(g·min)。

圖1 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系POD活性的變化

2.2 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系PAL活性的變化

如圖2所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系的PAL活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)?？共o(wú)性系的PAL活性均較感病無(wú)性系有所提高,抗病無(wú)性系的PAL活性在48 h達(dá)最高；抗病無(wú)性系經(jīng)尖孢鐮刀菌處理后,PAL活性峰值比感病無(wú)性系提高了93.34 U/(g·min)；抗病無(wú)性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,PAL活性峰值比感病無(wú)性系提高了203.33 U/(g·min)。

圖2 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系PAL活性的變化

2.3 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系PPO活性的變化

如圖3所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系的PPO活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)?？共o(wú)性系的PPO活性均比感病無(wú)性系的高,抗病無(wú)性系的PPO活性在48 h達(dá)最高；抗病無(wú)性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,PPO活性峰值比感病無(wú)性系提高了64.00 U/(g·min)；抗病無(wú)性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,PPO活性峰值比感病無(wú)性系提高了53.20 U/(g·min)。

2.4 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

如圖4所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系的β-1,3-葡聚糖酶活性均呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)?？共o(wú)性系的β-1,3-葡聚糖酶活性急劇上升,在72 h時(shí)達(dá)最高；抗病無(wú)性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,其β-1,3-葡聚糖酶活性峰值比感病無(wú)性系提高了142.00 U/(g·min)；抗病無(wú)性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,其β-1,3-葡聚糖酶活性峰值比感病無(wú)性系提高了107.00 U/(g·min)。

2.5 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系幾丁質(zhì)酶活性的變化

如圖5所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系的幾丁質(zhì)酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)?？共o(wú)性系的幾丁質(zhì)酶活性比感病無(wú)性系有所提高,但峰值提高不明顯。

圖3 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系PPO活性的變化

圖4 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

圖5 抗病無(wú)性系和感病無(wú)性系幾丁質(zhì)酶活性的變化

3 結(jié)論與討論

寄主植物的抗病性是建立在一系列物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)之上的,其中催化這些物質(zhì)代謝反應(yīng)的酶是關(guān)鍵。PAL是植物莽草酸通路的關(guān)鍵酶和限速酶,在木質(zhì)素的積累、植保素和酚類(lèi)物質(zhì)的合成中起十分關(guān)鍵的作用。POD是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一,在阻止活性氧的形成、清除活性氧等方面起著十分重要的作用,POD活性可間接反映寄主植物體內(nèi)的活性氧代謝情況[19]。PPO能將寄主植物體內(nèi)的酚類(lèi)物質(zhì)氧化成對(duì)病原菌有毒害作用的醌類(lèi)物質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在接種尖孢鐮刀菌和用尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無(wú)性系的POD、PAL和PPO活性均呈先上升后降低的趨勢(shì)。

病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)的累積是寄主植物獲得系統(tǒng)抗病性的重要因子,β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶是寄主植物中重要的病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)。寄主植物中的幾丁質(zhì)酶是其體內(nèi)與抗病性緊密相關(guān)的一種酶，它能將病原真菌的菌絲細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)進(jìn)行酶解,導(dǎo)致原生質(zhì)膜破裂,從而破壞病原菌菌絲,抑制病原菌的菌絲生長(zhǎng),破壞細(xì)胞內(nèi)新物質(zhì)的累積,最終導(dǎo)致病原真菌死亡。此外,酶解后產(chǎn)生的病原真菌細(xì)胞壁降解物還能發(fā)揮誘導(dǎo)物的作用,激活寄主植物的抗病性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在接種尖孢鐮刀菌和用尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無(wú)性系的幾丁質(zhì)酶活性呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)。

β-1,3-葡聚糖酶參與代謝合成的產(chǎn)物可以作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)與其他抗病反應(yīng)有關(guān)的酶系,這些酶類(lèi)可以促進(jìn)木質(zhì)素、植保素等抗病物質(zhì)的合成與累積,從而加強(qiáng)寄主植物的抗病性[21]。本實(shí)驗(yàn)中百合抗病無(wú)性系在接種尖孢鐮刀菌和經(jīng)尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后，其體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶的活性增強(qiáng),表明尖孢鐮刀菌毒素可能誘導(dǎo)了寄主植物的抗病性,且可能與植物的系統(tǒng)獲得抗病性有關(guān)系。但在本研究中β-1,3-葡聚糖酶的活性呈現(xiàn)一直上升的狀態(tài)并未形成山峰狀,這可能是因?yàn)檎T導(dǎo)處理時(shí)間短。