華智銳，李小玲

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

黃芩(Scutellariabaicalensis)又叫山茶根，是唇形科黃芩屬多年生的草本植物，黃芪的根可以清熱、下火、除濕、安胎，也有一定的解毒作用[1-3]。人工種植黃芩成為了國內(nèi)黃芩產(chǎn)量的主要來源,但不合理的種植方式、環(huán)境惡化等因素，使鹽漬化土地面積越來越大，影響到了黃芩的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，如何能使黃芩在鹽漬化環(huán)境下正常生長并能使黃芩生長、發(fā)育和產(chǎn)量、品質(zhì)得到提高，對藥用植物耐鹽性、抗鹽生理和抗性育種及合理高效利用鹽漬化土壤均具有重要意義。鹽漬化的土地主要影響作物的萌發(fā)及生長、對水分吸收和生物膜通透性[4-5]。

細胞胞內(nèi)的第二信使Ca2+能夠與鈣調(diào)素(CaM)作用，在植物生長過程中的信號傳遞方面發(fā)揮作用[6]。同時鈣離子也能穩(wěn)定生物膜的結(jié)構(gòu)，維持細胞膜的完整性，其作用原理是它把生物膜表面的磷酸酯與蛋白質(zhì)的羥基相結(jié)合。鈣在作物對有機物的選擇性吸收、生長發(fā)育、信號的傳遞以及作物的耐鹽性方面發(fā)揮著重要的功能[7-8]。所以高鹽環(huán)境下加入一定濃度的外源鈣，不僅能夠提高細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性，保持鈣信號通路的正常傳遞，以達到維持細胞內(nèi)各種離子動態(tài)平衡的目的，還可以解決因鈣離子濃度不夠造成的礦物質(zhì)營養(yǎng)缺失問題。

當前關于Ca2+對高鹽條件下植物生理特性影響的研究主要還是集中在玉米、甜菜[9]、小麥[10]等作物方面，但是對具有極高藥用價值的作物方面，通過施加外源物緩解鹽漬傷害的報道比較少，因此探尋一種效益高、低成本提高黃芩抗逆性的方法，對藥用植物黃芩具有重要的現(xiàn)實意義。本研究用商洛一年生黃芩幼苗為材料，探尋了Ca2+對鹽脅迫下黃芩的生理效應，以期為黃芩的抗性生理研究、大田生產(chǎn)和合理施肥等提供一定的理論依據(jù)和現(xiàn)實參考。

1 材料與方法

1.1 材料

商洛一年生黃芩幼苗，2019年4月6日移栽于直徑為50 cm的花盆中，每盆3～4株，共移栽21盆。

1.2 試驗方法

1.2.1 預試驗 用不同濃度梯度的NaCl倍液(0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)處理黃芩一年生盆栽幼苗，測定分析其生理指標的變化趨勢，確定黃芩幼苗耐鹽脅迫閾值。

1.2.2 材料處理 經(jīng)過預試驗得出了黃芩幼苗耐鹽脅迫閾值，以閾值的NaCl濃度模擬鹽脅迫環(huán)境，待黃芩幼苗生長兩周后，將實驗材料分為7組。試驗共設2個對照和5個處理：CK1(蒸餾水對照)；CK2(鹽脅迫對照)；T1(0.2 mmol/L CaCl2+鹽脅迫閾值)；T2(0.4 mmol/L CaCl2+鹽脅迫閾值)；T3(0.6 mmol/L CaCl2+鹽脅迫閾值)；T4(0.8 mmol/L CaCl2+鹽脅迫閾值)；T5(1.0 mmol/L CaCl2+鹽脅迫閾值)。將長勢一致的黃芩幼苗移栽到經(jīng)過以上試驗處理的花盆中，每盆種植3～4株，每個處理種植3個花盆。用不同濃度的CaCl2和鹽脅迫閾值每次各噴施2 mL，每2 d噴施一次，噴灑強度為密布葉面而不下流。分別在脅迫4、8、12 d后采集葉片，測定黃芩葉片的MDA含量、脯氨酸含量、SOD、POD和CAT活性的變化。

1.3 測定指標與方法

保護酶的測定參照高俊鳳等[11]的方法；MDA 含量的測定參照趙世杰等[12]的方法；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測定采用蒽酮比色法。

酶液的制備：稱取0.5 g黃芩葉片，洗凈擦干水分，研磨，勻漿移入10 mL離心管中，用冷凍離心機離心20 min，轉(zhuǎn)速為10000 r/min。上清液即為酶液，置于0～4 ℃下保存待用。

1.3.1 SOD活性的測定 用移液槍取20 μL的酶液，用移液管加入3 mL SOD反應液，光照(4000 lx)30 min，設3個對照、1個空白；空白避光保存，對照組與酶液照光(4000 lx)30 min，遮光保存；使用分光光度計在560 nm下比色。

SOD總活性(吸光度/g)=(ACK-AE)×V/(W×0.5×ACK)，ACK為對照管(光照)的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為提取酶液總體積(mL) ；W為葉片鮮重(g)；以NBT光還原50%為單位。

1.3.2 POD活性的測定 用移液槍取20 μL的酶液，用移液管加入3 mL POD反應液，在470 nm下每隔1 min讀一次數(shù)，共讀數(shù)3次。

POD活性[ΔA470/(min·g)]=ΔA470×V/Va/W=ΔA470×5/0.02/0.5=ΔA470×500，式中A470為反應時間內(nèi)OD 變化值。

1.3.3 CAT活性的測定 用移液槍取20 μL的酶液，用移液管加入2.5 mL CAT反應液，在240 nm下比色，每隔1 min讀數(shù)1次，共讀數(shù)3次。

CAT活性[ΔA240/(min·g)]= ΔA240×V/Va/W=ΔA240×200

1.3.4 丙二醛含量的測定 稱取0.5 g剪碎的試材，用移液管吸取5 mL 10% TCA 溶液，研磨到勻漿，離心10 min。在2 mL上清液中加入2 mL 0.6% TBA 溶液，沸水浴加熱15 min，然后再次離心，取上清液在532、450、600 nm 波長下比色。

MDA含量(μmol/g)=[6.45×(D532-D600)-0.56 D450]×0.015/W或[6.45×(D532-D600)-0.56 D450]×0.03/W。

1.3.5 脯氨酸含量的測定 將不同處理的黃芩葉片各采摘3 份，每份0.3 g，加入80%乙醇，研磨成勻漿，用 80%乙醇定容，在80 ℃水浴中加熱20 min。稱取材料0.3 g，加入5 mL磺基水楊酸，沸水浴 10 min，過濾，吸取濾液 2 mL加2 mL 冰醋酸和3 mL 酸性茚三酮，沸水浴 40 min，冷卻，加入 5 mL甲苯，取上層溶液于比色皿中，在 520 nm 下比色。

脯氨酸含量(μg / g)=C×V/Va/W，其中C為脯氨酸濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測定不同處理各重復3次，實驗數(shù)據(jù)為3次測定的平均值。采用Microsoft Excel 2007軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗過氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖1知，在處理4、8、12 d的黃芩葉片中，對照組(CK2)的SOD活性比CK1有所下降；在NaCl閾值(0.5%)脅迫下隨著外源鈣濃度的升高SOD 的活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理4 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5處理的SOD活性與對照(CK2)相比分別提高了4.8%、9.2%、9.2%、18%、6.4%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理的SOD活性達到最佳即200(吸光度/g)，是CK2的1.45倍，差異達顯著水平(P<0.05)；在處理8 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5處理的SOD活性與對照( CK2)相比分別提高了14.7%、24.7%、31.5%、37.1%、33.3%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理的SOD 活性達到最佳即196(吸光度/g)，是CK2的2.18倍，差異達極顯著水平(P<0.01)；在處理12 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5處理的SOD活性與對照(CK2)相比分別提高了14.1%、19.1%、32.4%、34.3%、15.7%。T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理的SOD 活性達到最佳即143(吸光度/g)，是CK2的2.17倍，差異達極顯著水平(P<0.01)。由此可知，經(jīng)過處理8 d的黃芩幼苗在T4處理下SOD的活性是對照組(CK2)的2.18倍，值為196(吸光度/g)，即T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理對鹽脅迫下黃芩幼苗的緩解作用最為顯著。

2.2 外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗過氧化物酶(POD) 活性的影響

由圖2知，在處理4、8、12 d的黃芩葉片中，對照組(CK2)的POD活性比CK1有所下降；在 NaCl閾值(0.5%)脅迫下隨著外源鈣濃度的增加POD的活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理4 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性與對照(CK2)相比分別提高了17%、14%、28%、40%、12%，其中T4處理的POD活性達到最佳，即255 ΔA470/(min·g)，是CK2的232倍，差異達極顯著水平(P<0.01)；在處理8 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性與對照(CK2) 相比分別提高了22%、38%、41%、48%、43%，T4處理的POD活性達到最佳即346 ΔA470/(min·g)，是CK2的2.88倍，差異達極顯著水平(P<0.01)；在處理12 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的POD活性與對照(CK2)相比分別提高了16%、17%、21%、24%、17%，T4處理的POD活性達到最佳即148 ΔA470/(min·g)，是CK2的 1.64倍，差異達極顯著水平(P<0.01)。同時在T4處理下，8 d的POD活性比4 d的POD活性高15%，比12 d的POD活性高40%，由此可知，經(jīng)過處理8 d的黃芩幼苗在T4處理下POD的活性是對照組(CK2)的 2.88倍，值為346 ΔA470/(min·g)，即T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理能有效提高POD 活性。

圖1 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗SOD活性的影響

圖2 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗POD活性的影響

2.3 外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖3知，在處理4、8、12 d的黃芩葉片中，對照組(CK2)的CAT活性比CK1有所下降；在NaCl閾值(0.5%)脅迫下隨著外源鈣濃度的升高CAT的活性都呈先上升后下降的趨勢，在處理4 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性與對照(CK2)相比分別提高了22%、33%、54%、31%、25%，其中T3處理的CAT活性達到最佳即337 ΔA240/(min·g)；在處理8 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性與對照(CK2)相比分別提高了7%、6%、36%、27%、31%，其中T3處理的CAT活性達到最佳即236ΔA240/(min·g)；在處理12 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的CAT活性與對照(CK2)相比分別提高了5%、23%、45%、21%、6%，T3處理的CAT活性達到最佳即257 ΔA240/(min·g)；同時在T3處理下4、8、12 d的CAT活性分別是 CK2的4.88倍、2.15倍、2.65倍，差異達極顯著水平(P<0.01)。由此可知，經(jīng)過處理4 d的黃芩幼苗在T3(0.6 mmol/L CaCl2)處理下CAT的活性達到峰值，值為337 ΔA240/(min·g)，即T3(0.6 mmol/L CaCl2)處理對鹽脅迫黃芩幼苗的緩解作用最為顯著。

圖3 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗CAT活性的影響

2.4 外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗中丙二醛(MDA)含量的影響

由圖4知，在處理4、8、12 d的黃芩葉片中對照組(CK2)的MDA含量比CK1明顯有所上升；在NaCl閾值(0.5%)脅迫下隨著外源鈣濃度的升高MDA含量都呈下降的趨勢。在處理4 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、 T5的MDA含量與對照(CK2)相比分別降低了26%、36%、55%、79%、78.9%；在處理8 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的MDA含量與對照(CK2) 相比分別下降了48.1%、33.3%、60.0%、63.0%、66.7%,其中T5處理的MDA含量最低即0.04 μmol/g，CK2是 T5的 5倍，差異達極顯著水平(P<0.01)；在處理12 d的黃芩葉片中，T1、T2、T3、T4、T5的MDA含量與對照(CK2) 相比分別降低了8%、24%、31.3%、40%、61.5%。T5處理的MDA含量最低，為0.05 μmol/g，CK2是T5的4.2倍，差異達極顯著水平(P<0.01)。由此可知，與對照組相比，隨著CaCl2濃度的升高鹽脅迫下黃芩幼苗中MDA含量呈下降趨勢。

圖4 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

2.5 外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗中脯氨酸含量的影響

由圖 5 可知，在處理4、8、12 d的黃芩葉片中，在NaCl閾值(0.5%)處理下隨著鈣離子濃度的增加脯氨酸含量都呈先上升后下降趨勢。T4處理與對照組CK2相比，處理4 d的黃芩葉片中脯氨酸含量比CK2高46%，處理8 d的黃芩葉片中脯氨酸含量比CK2高37%，處理12 d的黃芩葉片中脯氨酸含量比CK2高21%，且分別是CK2的2.69、2.18、1.53倍。T4處理脯氨酸含量分別達0.043、0.074、0.061 μg/g，即在T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理下，脯氨酸含量達最大值0.074 μg/g。

圖5 不同濃度外源鈣對鹽脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

3 討論

SOD在生物體內(nèi)的活性的高低是作物衰老和萎蔫的直觀指標[12]；已有研究證實，SOD可以阻止氧自由基對細胞造成的損傷，能夠很快修復受到傷害的細胞[13]。SOD在保持生物細胞內(nèi)的活性氧代謝的穩(wěn)定和保護植物細胞膜結(jié)構(gòu)方面扮演著尤為重要的角色[14]。過氧化物酶(POD)是把H2O2當作電子受體從而來催化底物發(fā)生氧化作用的酶。在作物萌發(fā)生長過程中，不同階段POD的活性不同。老化的組織部分POD活性比較高而才萌發(fā)的組織中它的活性比較低。所以過氧化物酶活性的高低可以作為表征植物組織衰老的一種指標[15]。本研究中，以NaCl閾值(0.5%)脅迫黃芩幼苗，噴施不同濃度的鈣離子，通過測定黃芩葉片中SOD、POD、CAT的活性。發(fā)現(xiàn)黃芩幼苗中SOD、POD、CAT 活性呈先升后降趨勢，其中SOD、POD、CAT活性均高于鹽對照組(CK2)。由此說明不同濃度的外源鈣具有提高鹽脅迫下黃芩幼苗中SOD、POD、CAT活性的作用，其中POD、SOD活性在T4(0.8 mmol/L CaCl2)時達到峰值，POD活性為346 ΔA470/(min·g)，SOD活性為196(吸光度/g)；CAT活性在T3(0.6 mmol/L CaCl2)時達到峰值337 ΔA240/(min·g)。

在鹽漬條件下，作物的細胞質(zhì)膜受到損害，膜脂間發(fā)生過氧化作用的產(chǎn)物之一是丙二醛[16-18]。已有研究表明[19-20]：丙二醛(MDA)的含量可以通過添加一定濃度的外源鈣而降低。丙二醛能夠讓膜的通透性加大的原理是其與膜蛋白產(chǎn)生交聯(lián)反應，從而導致生物膜系統(tǒng)內(nèi)很多保護酶的生理功能遭到破壞。所以可以用 MDA含量的多少來反映生物膜脂過氧化程度的強弱，以及作物受到損傷的程度。本研究中，在0.5% NaCl閾值(0.5%)脅迫下，經(jīng)過不同濃度的外源鈣處理后的黃芩幼苗中MDA含量均低于對照組(CK2)，這與尹大川等[21]的研究結(jié)果一致。說明一定濃度的鈣離子通過降低MDA含量緩解細胞膜脂過氧化程度，從而緩解鹽漬化條件對黃芩的損害。

已有研究報道[22-23]，植物在萎蔫的過程中脯氨酸的含量也非常高，脯氨酸作為細胞親和溶質(zhì)，它的含量可以影響滲透調(diào)節(jié)[24-26]。因此，脯氨酸是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在鹽脅迫作用下作物體內(nèi)脯氨酸大量積累，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外的滲透壓，使細胞維持動態(tài)平衡[27-28]。本試驗中，不同濃度外源鈣處理中脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降趨勢，即在T4(0.8 mmol/L CaCl2)處理下，脯氨酸含量達最大值0.074 μg/g。

綜合以上結(jié)果，可以看出，一定濃度的外源鈣處理鹽脅迫下一年生黃芩幼苗，能有效提高SOD、POD、CAT活性和脯氨酸的積累量，降低丙二醛(MDA)含量，增強植株抗逆性，緩解鹽脅迫傷害，其中在T4處理下即添加0.8 mmol/L CaCl2的緩解效果最佳。本研究結(jié)果能為黃芩的生產(chǎn)栽培和抗性育種研究提供一定參考和借鑒。黃芩屬于多年生藥用植物，但本試驗僅選取了一年生黃芩幼苗開展了短時間的集中盆栽生理生化試驗探索，要全面了解外源鈣對黃芩鹽脅迫傷害的緩解效應和作用機制，還有待結(jié)合大田生產(chǎn)實踐在不同生育期開展生理和分子層面更深入研究。