王 茹,馮 永,李昆志,王 晉,許 永,田麗梅,繆恩銘,耿詠勤,蔣次清,陳建華,魏玉玲,唐 萍,李雪梅,陳麗梅,張承明*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,云南 昆明 650023；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

甲醛(FA)是所有脂肪醛中最簡(jiǎn)單的一種有機(jī)化合物,其化學(xué)式為HCHO。在室溫下,FA是一種無(wú)色、易溶、有刺激性氣味的氣體[1]。長(zhǎng)時(shí)間暴露在甲醛中可引起一系列慢性呼吸道疾病,包括上呼吸道黏膜肥大或萎縮、慢性咽炎、鼻炎、鼻竇炎和鼻咽炎等[2]。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有有機(jī)化合物都能不同程度地被微生物降解和轉(zhuǎn)化,甲醛作為一種天然存在的有機(jī)物也不例外。隨著甲醛的廣泛應(yīng)用,由此帶來的甲醛污染問題受到越來越多的重視。

Azachi等[3]在使用甲醛生產(chǎn)膠水的工廠附近的土壤中分離出1株Halomonassp. MA-C,研究發(fā)現(xiàn)其能在甲醛濃度為75～100 mg/L的環(huán)境下生長(zhǎng)良好。楊郁等[4]從活性污泥中分離出1株能降解甲醛的蘇云芽孢桿菌,其在含1.2 μg/mL甲醛的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)36 h后,對(duì)甲醛的去除率達(dá)到72%。

目前,針對(duì)降解甲醛的微生物,國(guó)內(nèi)外做了較多研究,主要涉及的降解微生物是甲基營(yíng)養(yǎng)菌及部分非甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌、酵母及真菌[5]。非甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌包括甲基球菌屬(Methylococcus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、胃分枝桿菌屬(Mycobacteriumgastri)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、醋酸菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)等。真菌包括擬青霉(Paecilomycessp.)、曲霉(Aspergillussp.)和木霉(Trichodermasp.)等[6-7]。

微生物對(duì)甲醛的代謝途徑主要分為將甲醛轉(zhuǎn)化為細(xì)胞組分的同化途徑和將甲醛分解為 CO2和水的異化途徑。甲醛同化途徑包括絲氨酸途徑、核酮糖單磷酸途徑、木酮糖單磷酸途徑；甲醛異化途徑分為兩大類,一類是甲醛與各種輔因子結(jié)合形成加合物進(jìn)而進(jìn)入代謝鏈，另一類是甲醛的環(huán)狀氧化途徑[8]。

應(yīng)用傳統(tǒng)的以微生物為基礎(chǔ)的活性污泥去除有機(jī)污染物,不僅難滿足現(xiàn)代工業(yè)的處理需求,而且其所攜帶的病原菌、寄生蟲、重金屬等有害物質(zhì)還會(huì)對(duì)環(huán)境帶來更嚴(yán)重的污染。因此我們首先從受甲醛污染的實(shí)驗(yàn)室廢水污泥和普通野外河泥中特定培養(yǎng)馴化出能降解高濃度甲醛及有機(jī)污染物的微生物,并對(duì)其進(jìn)行了初步形態(tài)及分子學(xué)鑒定。此外國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)于微生物的研究多集中于對(duì)微生物的篩選和降解特性的研究階段,未能深入了解這些菌的降解和代謝特性,不利于環(huán)境應(yīng)用的研發(fā)。我們進(jìn)一步考察了微生物對(duì)不同濃度甲醛的降解效果,以及通過13C-NMR核磁圖譜初步分析了篩選菌對(duì)甲醛的代謝特性,以期為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性污泥的獲取及包埋

本研究中活性污泥分別來源于昆明理工大學(xué)呈貢校區(qū)撈魚河的河泥與生科院植物組溫室污水處理池中的池泥。將收集的活性污泥與水混合,確?；钚晕勰嗟暮试?8%～99%；然后使用紗布進(jìn)行過濾，將其中的碎石等雜物去除；將剩余的泥水混合物與2%的海藻酸鈉溶液以1∶1的比例混合,將30 cm×20 cm×0.5 cm低密度海綿浸泡其中,待海綿吸收飽和后,去除海綿表面多余的凝結(jié)物及液體,使海綿表面保持平整且有很好的吸附和透氣能力；隨后將海綿放入含有4% CaCl2的溶液中,浸泡20 min后,取出，放入清水中過夜。

1.2 馴化裝置

本研究用氣體馴化裝置對(duì)包埋的活性污泥進(jìn)行馴化處理,該裝置如圖1所示。處理箱由收納盒改裝而來,在收納盒底部開有10 cm×10 cm的正方形開口,并安裝離心風(fēng)扇。在收納箱內(nèi)部正方形開口上方固定一塊漏網(wǎng)狀支撐板,這樣在處理箱底部就構(gòu)建了一個(gè)空氣間隔室,離心風(fēng)扇可將外界氣體吹入處理箱中。將包埋好河泥和池泥的海綿卷成大小一致的卷,放置于處理箱漏網(wǎng)狀支撐板上。包埋河泥和池泥的海綿卷共18個(gè),其擺放方式如圖1所示:在處理箱內(nèi)部左側(cè)放3層河泥海綿卷,每層3個(gè);在處理箱內(nèi)部右側(cè)放3層池泥海綿卷,每層3個(gè)。為了保持海綿的濕度,使用蛭石和濕潤(rùn)紗布覆蓋于海綿最上層。將馴化裝置組裝好后放入密閉玻璃箱進(jìn)行甲醛氣體處理。處理溫度保持在20～30 ℃,每天添加適量清水,使海綿含水量保持在30%～40%。

1.3 活性污泥的馴化

將處理箱放入密閉玻璃箱進(jìn)行甲醛馴化處理。向玻璃箱中添加甲醛,使其甲醛濃度從1 mg/m3起逐天遞增至最終的15 mg/m3,連續(xù)悶曝15 d。

1.4 篩菌培養(yǎng)基的配制

篩菌培養(yǎng)基配方為: KH2PO40.5 g、K2HPO41 g、(NH4)2SO42.6 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.01 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、酵母膏1.6 g、瓊脂1.5%[9]。使用5 mmol/L甲醇作為添加碳源,經(jīng)0.2 μm濾膜過濾,加入到高壓滅菌冷卻的培養(yǎng)基中。

1.5 菌種的富集與培養(yǎng)

收集兩種包埋活性污泥的海綿進(jìn)行菌株富集與培養(yǎng)。每條海綿只剪取5 cm左右,并將其剪碎,置于200 mL三角瓶中,使用不含有瓊脂的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液進(jìn)行菌種富集,于28 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)7 d。之后取出海綿,將剩余液體離心去上清,得到菌體,然后用500 μL無(wú)菌水懸浮,分別涂布在固體篩菌培養(yǎng)基上。于28 ℃培養(yǎng),直到長(zhǎng)出肉眼可見的菌落。挑選長(zhǎng)勢(shì)良好且形態(tài)不同的菌落進(jìn)一步劃線分離,從而獲得單菌落。

圖1 馴化裝置示意圖

1.6 結(jié)晶紫染色

用接種針挑取少許菌落,涂布于干凈的載玻片上并用清水稀釋,自然晾干或用酒精燈火焰烘干。用0.1%結(jié)晶紫溶液染色1 min,用干凈水流清洗。再用碘液媒染1 min,水洗。使用95%乙醇脫色30 s,至無(wú)色。使用番紅復(fù)染2～3 min,水洗,吸干。用顯微鏡觀察分離菌株細(xì)胞的形態(tài)和大小。

1.7 16s rRNA基因測(cè)序

將純化好的菌落,送至北京碩擎生物科技有限公司進(jìn)行16s rRNA基因測(cè)序。其16s rRNA基因引物為1492R:TACGGCTACCTTGTTACGACTT;27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

1.8 甲醛處理

將甘油保存的篩選菌液以1%(v/v)接種于含有酵母膏的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,于28 ℃搖床培養(yǎng),待其OD600值達(dá)到0.5時(shí)備用。分別配制甲醛濃度為4、8、10、15和20 mmol/L的無(wú)機(jī)鹽溶液。使用之前培養(yǎng)得到的OD600達(dá)到0.5的菌液,以1%(v/v)接種于含有不同濃度甲醛的培養(yǎng)基中,于28 ℃搖床培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)(8、12、24、36、48、60、72 h)取樣。離心后取上清,使用Nash法[10]測(cè)定甲醛濃度。

1.9 菌株H13CHO標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

為了分析H13CHO在菌體中的代謝途徑,用20%的H13CHO配制成濃度為4 mmol/L的處理液[5 mmol/L KHCO3、28 μL H13CHO、0.1% MES (w/v, pH 5.7)]100 mL,取3 g左右菌體,浸沒于處理液中,于25 ℃持續(xù)光照,搖床振蕩培養(yǎng)(100 r/min);再以8000 r/min離心15 min,收集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌體及處理液;將菌體用清水清洗2～3次,離心收集菌株。加入2 mL蒸餾水,超聲破碎15 min(超聲5 s、停止8 s，反復(fù)循環(huán)),以1000 r/min離心,收集菌體上清并進(jìn)行真空干燥,用0.5 mL無(wú)菌水溶解,加入5 μL去離子甲酰胺(5 mmol/L)作為內(nèi)參,與處理液分別進(jìn)行13C-NMR分析。

1.10 13C NMR分析

使用Bruker DRX 500-MHz(Bruker Biosciences Corporation, Billerica, MA)進(jìn)行NMR分析。數(shù)據(jù)參數(shù)為:寬帶質(zhì)子去耦5 μs(90Ω)脈沖,光譜寬度37594 Hz,采集時(shí)間0.5 s,延滯時(shí)間1.2 s。在25 ℃常溫下,每個(gè)樣品采集32000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),進(jìn)行1200次掃描。數(shù)據(jù)處理時(shí)線寬為4 Hz。所有化學(xué)位移以甲酰胺共振峰(166.600 mg/kg)為參照。在對(duì)物質(zhì)積分時(shí),甲酰胺共振峰積分為1,其他物質(zhì)以此為參照。

1.11 軟件使用

使用AutoCAD畫圖及3D打印技術(shù)制作處理箱零部件。將獲得的序列提交到NCBI的基因庫(kù)。通過BLAST,下載相似性較高的相關(guān)序列,使用MAGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

取位于馴化箱中不同層甲醛馴化包埋的活性污泥,將其所含有的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，涂抹在含有2 mmol/L甲醛的篩菌平板上。在池泥包埋活性污泥中,發(fā)現(xiàn)1個(gè)表面為灰白色的優(yōu)勢(shì)菌株。而在河泥包埋活性污泥中,發(fā)現(xiàn)1個(gè)表面為紅色的菌株。將這兩種菌種進(jìn)一步純化,得到單菌落。

取純化單菌落,用結(jié)晶紫對(duì)分離菌株進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下用油鏡放大1000倍,觀察菌體細(xì)胞的形態(tài),進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果如圖2所示。從甲醛馴化的河泥中分離的菌落我們命名其為R1,該菌株的菌落較小且呈圓形,紅色,表面光滑濕潤(rùn)。從甲醛馴化的池泥中分離得到的優(yōu)勢(shì)灰白色菌落我們命名為Y1,該菌株的菌落為灰白色,不透明,菌落較大。

圖2 兩種分離菌株的菌落形態(tài)

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將純化好的R1菌株交由北京碩擎生物科技有限公司進(jìn)行16s rRNA基因測(cè)序。測(cè)序長(zhǎng)度為1344 bp；通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示菌株R1與甲基桿菌(Methylobacterium)的同源性達(dá)到99%,初步鑒定其為甲基桿菌。進(jìn)一步通過與其他具有代表性的幾株菌株的16s rRNA基因序列的比對(duì),構(gòu)建菌株R1的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3左),結(jié)果表明菌株R1為甲基桿菌,且與甲基桿菌菌株MethylobacteriumzatmaniiDSM 5688的親緣關(guān)系最近。

將純化好的菌株Y1進(jìn)行16s rRNA基因測(cè)序。測(cè)序長(zhǎng)度為1341 bp；通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示菌株Y1與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的同源性達(dá)到99%,初步鑒定其為蠟樣芽孢桿菌。進(jìn)一步通過與其他具有代表性的幾株菌株的16s rRNA基因序列的比對(duì),構(gòu)建菌株Y1的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3右),結(jié)果表明菌株Y1為蠟樣芽孢桿菌,且其與蠟樣芽孢桿菌菌株BacillusATCC14579和BacillusJH792233s最為相似。

2.3 篩選菌株對(duì)液體甲醛的吸收能力

為了檢測(cè)菌株R1對(duì)甲醛的降解情況,把3 g菌R1分別浸沒在含有4、8、10、15和20 mmol/L的甲醛溶液中,在不同時(shí)間點(diǎn)取樣,測(cè)定溶液中剩余甲醛濃度,并以溶液中剩余甲醛濃度占起始甲醛濃度的百分率作圖,所得結(jié)果如圖4所示,隨著時(shí)間的增加,不同處理液中剩余甲醛濃度都呈逐漸降低的趨勢(shì)。在72 h時(shí),菌R1能完全清除4、8 mmol/L處理液中的甲醛,而在10 mmol/L處理液中還有9%的甲醛剩余,在15 mmol/L處理液中有30%的甲醛剩余,在20 mmol/L處理液中有36%的甲醛剩余。這表明菌R1可以吸收甲醛,但其對(duì)不同濃度的液體甲醛吸收能力不同。菌R1對(duì)10 mmol/L以下濃度甲醛的吸收能力較強(qiáng),對(duì)10 mmol/L以上濃度甲醛的吸收能力較差。菌R1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收速率可以根據(jù)溶液中甲醛揮發(fā)量和甲醛的剩余量計(jì)算得出,結(jié)果如圖4所示。菌R1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收量與時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系,根據(jù)該吸收曲線的斜率可以計(jì)算菌R1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收速率。在0～12 h期間,菌R1對(duì)4、8、10、15和20 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別為22.22、42.00、41.67、41.67和50.00 μmol/(L·g·h);在12～36 h期間,菌R1對(duì)4、8、10、15和20 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別上升為22.22、42.33、48.61、29.17和33.33 μmol/(L·g·h);在36～72 h期間,菌R1對(duì)4、8、10、15和20 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別為12.59、18.15、26.85、30.28和48.15 μmol/(L·g·h);說明甲基桿菌R1在12 h之內(nèi)對(duì)甲醛的降解效率并不是太高,而在12 h之后其對(duì)甲醛的降解速率開始出現(xiàn)較大提升。這可能說明在12 h之前其生長(zhǎng)比較緩慢,菌體較少；在12 h之后其逐步進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期,菌量增多。而在36 h之后其對(duì)甲醛的降解速率又下降，可能是因?yàn)樘幚硪褐屑兹┖繙p少,導(dǎo)致菌R1可吸收的甲醛量減少。

圖3 菌株R1和Y1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 菌株R1吸收不同濃度液體甲醛的動(dòng)力學(xué)曲線

如圖5所示,隨著時(shí)間的增加,不同處理液中剩余甲醛濃度都呈逐漸降低的趨勢(shì)。在72 h時(shí),菌Y1能完全清除4 mmol/L處理液中的甲醛,而8 mmol/L處理液中還有16%的甲醛剩余,10 mmol/L處理液中還有38%的甲醛剩余,15 mmol/L處理液中有64%的甲醛剩余。這表明菌Y1可以吸收甲醛,但其對(duì)不同濃度的液體甲醛的吸收能力不同。菌Y1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收量可以根據(jù)溶液中甲醛揮發(fā)量和甲醛的剩余量計(jì)算得出,結(jié)果如圖5所示。菌Y1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收量與時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系,根據(jù)該吸收曲線的斜率可以計(jì)算菌Y1對(duì)不同濃度液體甲醛的吸收速率。在0～12 h期間,菌Y1對(duì)4、8和10 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別為13.89、22.00和13.89 μmol/(L·g·h);在12～36 h期間,菌Y1對(duì)4、8和10 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別上升為18.61、35.44和34.72 μmol/(L·g·h)，菌Y1對(duì)15 mmol/L液體甲醛的吸收速率為12.50 μmol/(L·g·h);這可能是由于在12 h之前菌Y1生長(zhǎng)比較緩慢,菌體較少。在36～72 h期間,菌Y1對(duì)4、8、10和15 mmol/L液體甲醛的吸收速率分別為17.78、25.33、18.52和19.44 μmol/(L·g·h);以8、10和15 mmol/L液體甲醛的吸收速率結(jié)果為例,菌株Y1對(duì)液體甲醛的吸收量與時(shí)間呈冪函數(shù)關(guān)系。

圖5 菌株Y1吸收不同濃度液體甲醛的動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 菌株R1液體H13CHO代謝圖譜分析

為了進(jìn)一步了解菌R1的H13CHO代謝情況,首先用4 mmol/L液體H13CHO處理菌R1,處理時(shí)間分別為4 h和24 h。對(duì)菌R1液體H13CHO的代謝譜進(jìn)行分析,并以未經(jīng)任何處理的R1的13C NMR代謝譜作為對(duì)照。結(jié)果如圖6所示,在H13CHO脅迫2 h時(shí),大部分物質(zhì)的信號(hào)峰都出現(xiàn)下降趨勢(shì)；隨著H13CHO處理時(shí)間的增加,所有物質(zhì)的信號(hào)峰開始回升,最為明顯的是[3-13C]Ser和[3,4-13C]Malate,在處理24 h時(shí)分別達(dá)到對(duì)照的5.6倍和6.0倍(表1),這表明[3-13C]Ser和[3,4-13C]Malate是菌R1 H13CHO代謝的主要產(chǎn)物。除此之外,相較于處理2 h時(shí),處理24 h時(shí)的甲酸增加了2倍,[2-13C]Gly增加了6倍,PGA增加了4倍(表1)。

為了進(jìn)一步探討菌R1吸收代謝液體甲醛的生理機(jī)制,收集4 mmol/L液體H13CHO處理液進(jìn)行核磁共振分析。由圖7可知,在2 h時(shí),處理液中本身含有H13CHO,但除此之外還出現(xiàn)了新的13C共振峰,解譜后我們發(fā)現(xiàn)其歸屬為甲酸,且此時(shí)的甲酸濃度是對(duì)照的34倍。說明R1在代謝甲醛的過程中不僅可以產(chǎn)生大量甲酸,而且還能將甲酸分泌到處理液中。隨著處理時(shí)間的增加,甲酸的信號(hào)峰逐漸減弱,下降至2 h時(shí)的44%。說明隨著時(shí)間的增加，分泌的甲酸又可以被R1作為碳源加以吸收代謝。

表1 4 mmol/L H13CHO處理4 h、24 h的菌R1中H13CHO代謝物的相對(duì)含量

2.5 菌Y1液體H13CHO代謝圖譜分析

如圖8所示,在4 mmol/L H13CHO脅迫下,Y1各物質(zhì)信號(hào)峰在2 h時(shí)都有所下降,這可能是因?yàn)樵谠缙诩兹?duì)菌Y1產(chǎn)生了毒害作用。但之后在24 h時(shí)信號(hào)峰又出現(xiàn)回升,尤其是[3-13C]Ser、PEP、[2-13C]Gly、GSH等的信號(hào)峰回升較為明顯，其中[3-13C]Ser是2 h時(shí)的1.75倍,[2-13C]Gly是2 h時(shí)的1.73倍,GSH是2 h時(shí)的1.27倍(表2)。

用0.5 mL無(wú)菌水溶解,加入5 μL去離子甲酰胺(5 mmol/L)作為內(nèi)參,通過13C-NMR分析處理液中是否含有分泌的代謝產(chǎn)物,以不加甲醛處理的溶液為對(duì)照。結(jié)果(圖9)發(fā)現(xiàn)：處理4 h后處理液中出現(xiàn)了游離甲酸，且此時(shí)的甲酸濃度是對(duì)照的30倍，說明Y1在代謝甲醛的過程中同樣產(chǎn)生了大量甲酸,而且還能將甲酸分泌到處理液中。隨著處理時(shí)間的增加,甲酸的信號(hào)峰逐漸減弱,下降至2 h時(shí)的90%，說明隨著處理時(shí)間的增加部分分泌的甲酸又可以被Y1作為碳源加以吸收代謝。

菌株R1代謝H13CHO的13C NMR全譜(H13CHO處理時(shí)間如圖左端所示)。CK為未處理的菌株R1。13C NMR譜中各個(gè)共振峰的歸屬如下: Ref, 166.660 mg/kg (甲酰胺); H13COOH, 170.69 mg/kg; [3-13C]Ser, 60.08 mg/kg; [2-13C]Ser, 56.94 mg/kg; [2-13C]Gly, 40.41 mg/kg; [4-13C]Malate, 37.25 mg/kg; [3-13C]Malate, 66.88 mg/kg; PGA,71.42 mg/kg; PEP 27.13、50.19 mg/kg。

圖6 菌株R1代謝H13CHO的中間產(chǎn)物分析結(jié)果

菌株R1 H13CHO處理液的13C NMR全譜(H13CHO處理時(shí)間如圖左端所示)。其中B圖為H13COOH的相對(duì)積分。13C NMR譜中各個(gè)共振峰的歸屬如下: Ref, 166.660 mg/kg (甲酰胺); H13COOH, 170.69 mg/kg。

圖7 菌株R1 H13CHO處理液的13C-NMR分析結(jié)果

3 討論

本研究在不同來源的活性污泥中分離鑒定出兩種菌株,其中R1為甲基營(yíng)養(yǎng)型的甲基桿菌(Methylobacterium),甲基桿菌又稱為甲基營(yíng)養(yǎng)菌(Methylotrophy),是一種能夠利用低碳化合物如甲醛、甲醇、甲烷等碳源和能源的生物[11]。目前甲基桿菌主要被用來生產(chǎn)商業(yè)單細(xì)胞蛋白等物質(zhì)以及環(huán)境的凈化等[12]。我們篩選的甲基桿菌R1在20 mmol/L甲醛處理液中能去除36%的甲醛。相較于國(guó)內(nèi)李章良等[13]篩選的菌株,菌R1有更好的吸收效率。Y1為非甲基營(yíng)養(yǎng)型的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。蠟樣芽孢桿菌常見于土壤灰塵和污水中,在自然界廣泛存在。大多數(shù)蠟狀芽孢桿菌利用鞭毛運(yùn)動(dòng),在固體培養(yǎng)基上呈不規(guī)則菌落,使用葡萄糖作為碳源但不能利用甘露糖、阿拉伯糖或木糖,可水解淀粉和明膠,具有溶血活性,可抗氨芐青霉素,并顯示明顯的卵磷脂酶活性。Kostka等[14]發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽(yáng)性菌如蠟樣芽孢桿菌可用于石油等多環(huán)芳烴的降解。如蠟樣芽孢桿菌ACE4可降解幾乎所有的正烷烴污染物[15]。蠟樣芽孢桿菌DRDU1在四周內(nèi)可降解64%的原油和71%的柴油[16]。此外，Rupa Rani等[17]研究發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌還可以用于硫丹等殺蟲劑的降解。這些結(jié)果說明蠟狀芽孢桿菌有降解有機(jī)物的作用。

菌株Y1代謝H13CHO的13C NMR全譜(H13CHO處理時(shí)間如圖左端所示)。CK為未處理的菌株Y1。13C NMR譜中各個(gè)共振峰的歸屬如下: Ref, 166.660 mg/kg (甲酰胺); [3-13C]Ser, 60.08 mg/kg; [2-13C]Gly, 40.41 mg/kg; [4-13C]Malate, 37.25 mg/kg; [3-13C]Malate, 66.88 mg/kg; PGA, 71.42 mg/kg; PEP, 27.13、50.19 mg/kg; GSH,26.38、31.60、38.91、43.76、52.07、54.58、76.32 mg/kg。

圖8 菌株Y1代謝H13CHO的中間產(chǎn)物分析結(jié)果

菌株Y1 H13CHO處理液的13C NMR全譜(H13CHO處理時(shí)間如圖左端所示)。其中B圖為H13COOH的相對(duì)積分。13C NMR譜中各個(gè)共振峰的歸屬如下: Ref, 166.660 mg/kg (甲酰胺); H13COOH, 170.69 mg/kg。

圖9 菌株Y1 H13CHO處理液的13C-NMR分析結(jié)果

盡管早在20世紀(jì)初第一次發(fā)現(xiàn)了具有甲基營(yíng)養(yǎng)能力的細(xì)菌,但是直到20世紀(jì)60年代至70 年代才對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)有了初步的了解。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn),甲基營(yíng)養(yǎng)菌存在多種代謝形式,并對(duì)其代謝體系有了更深入的研究。甲基菌是一類可以利用非C-C鍵低碳化合物的微生物。C-C化合物在甲基菌體內(nèi)首先被氧化成甲醛,隨后甲醛有兩種代謝途徑：一種是甲醛異化途徑,最終被氧化生成二氧化碳；另一種是在同化途徑下最終轉(zhuǎn)變?yōu)槠渥陨斫M成[18]。13C NMR代謝譜表明菌株R1、Y1可以將甲醛同化為有機(jī)酸,因此菌株R1、Y1存在甲醛同化途徑。很多甲基營(yíng)養(yǎng)菌都有同化甲醛的絲氨酸途徑,例如晁紅軍等[11]從沼氣池殘?jiān)蟹蛛x出1株Methylobacteriumsp. MB200的甲基桿菌,研究發(fā)現(xiàn)其具有絲氨酸代謝途徑,該途徑會(huì)產(chǎn)生5,10-亞甲基四氫葉酸、絲氨酸、乙醛酸、蘋果酸、甘氨酸等有機(jī)酸[19]。本研究篩選的菌株MethylobacteriumR1在代謝過程中產(chǎn)生了大量的關(guān)鍵產(chǎn)物[3-13C]Ser,隨后在[3,4-13C]Malate以及[2-13C]Gly等產(chǎn)物中出現(xiàn)了13C標(biāo)記,這與Quayle等[20]采用14C標(biāo)記甲醇培養(yǎng)兼性甲基營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌(PseudomonasAM1)的結(jié)果類似,因此推測(cè)菌株R1可能存在絲氨酸途徑。在BacilluscereusY1代謝過程中出現(xiàn)了大量的甲酸、谷胱甘肽等產(chǎn)物,說明菌株Y1同樣有代謝甲醛的能力。

表2 4 mmol/L H13CHO處理4 h、24 h的菌Y1中H13CHO代謝物的相對(duì)含量

4 結(jié)論

本研究從采集的活性污泥中篩選得到兩株具有高效吸收甲醛能力的菌株R1、Y1,根據(jù)其形態(tài)特征以及16s rRNA鑒定,判定菌株R1為甲基桿菌(Methylobacterium),菌株Y1為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

當(dāng)甲醛初始濃度<4 mmol/L時(shí),菌株R1和Y1都能夠完全吸收溶液中的甲醛。當(dāng)甲醛濃度增高至8、10、15 mmol/L時(shí),菌株R1在72 h時(shí)的甲醛吸收率分別為100%、91%、70%;菌株Y1在72 h時(shí)的甲醛吸收率分別為84%、62%、36%。

13C NMR分析發(fā)現(xiàn)，用4 mmol/L H13CHO處理篩選的菌株R1,其主要代謝產(chǎn)物為HCOOH、PGA、[3-13C] Ser、[2-13C] Gly、[3,4-13C] Malate；處理篩選的菌株Y1,其主要代謝產(chǎn)物為GSH、[2-13C] Gly、[3-13C] Ser、PEP。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)菌株R1、Y1在代謝甲醛的過程中會(huì)產(chǎn)生大量甲酸,并且會(huì)將甲酸分泌到處理液中；此后隨著處理時(shí)間的增加部分分泌的甲酸又可以被菌株作為碳源加以吸收代謝。