王麗婷 王成祥 孫洪亮 王雁林 李清春

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603

空卵泡綜合征(Empty follicle syndrome, EFS)是一種生殖障礙，盡管卵泡發(fā)育和雌二醇(E2)水平明顯正常，但在進行體外受精(In vitro fertilization, IVF)治療過程中，對患者進行誘導(dǎo)排卵后反復(fù)抽吸和沖洗成熟的卵泡，也無法獲取卵母細胞。EFS是否真正存在一直有爭議，部分學(xué)者認為EFS是由取卵過程中出現(xiàn)的操作失誤及藥物活性低下所致，有些學(xué)者則認為EFS是由卵泡發(fā)育障礙而導(dǎo)致的早期卵泡閉鎖，還有一部分人認為這可能與遺傳或基因突變相關(guān)。雖然文獻報道EFS發(fā)生率僅為0.045%～7%，但對其病因尚未有確切解釋，且對這種婦女成功生育的治療目前尚未有報道，嚴重影響了這部分患者的輔助生殖助孕結(jié)局及治療前景。本文通過對1例EFS患者進行基因檢測和家系分析，探究促黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(Luteinizing hormone / chorionic gonadotropin receptor，LHCGR)基因異常與EFS發(fā)生的關(guān)系，并對該類患者經(jīng)輔助生殖助孕后治療前景進行了討論。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取某院生殖醫(yī)學(xué)中心1例31歲女性不孕癥患者，經(jīng)過一系列檢查女方初步診斷為：原發(fā)性不孕癥、雙側(cè)輸卵管周圍粘連，疑為卵巢抵抗綜合征。男方診斷為：原發(fā)性不育癥、畸精子癥。根據(jù)夫妻雙方病情分析，行IVF超長方案助孕治療，對患者穿刺取卵過程中未見卵母細胞及顆粒細胞，結(jié)合患者以前的病史，我們考慮患者可能為EFS，但是什么原因引起的患者空卵泡，是不是有可能存在某些基因異常。在取得患者同意并簽署知情同意書后，我們將患者外周血送復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心，進行相關(guān)基因檢測并對患者進行家系分析。

本研究的患者在實驗前對本次實驗?zāi)康募斑^程均有充分的了解，患者表示自愿參與本次實驗，并簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會審批通過。

1.2 研究方法 對患者進行基因檢測，遺傳分析和靶向基因測序使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)從外周血中提取基因組DNA(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(德國齊根市)。使用Illumina HiSeq 3000平臺對患者的exome進行測序。在LHCGR中檢測到c.1823T>C，p.L608P(Leu608Pro)突變。用以下引物進行Sanger測序證實該候選基因：正向引物ATGCTTGGAGGATGGCTCTT；反向引物TTTTAGTGGGCAGTGTCA。

對該患者(先證者)的親屬進行調(diào)查，了解每位親屬的生育情況，是否有與患者同類的親屬，并將家系調(diào)查結(jié)果繪成家系圖進行分析。

2 結(jié)果

2.1 基因突變檢測結(jié)果 患者LHCGR基因第11號外顯子處，在圖1箭頭所指位置處存在純合突變：chr2:48915113A>G，c.1823T>C，p.Leu608Pro，突變使LHCGR蛋白在第608位由亮氨酸(Leucine, Leu)突變?yōu)楦彼?Proline ,Pro)，屬于純合突變。而父母在此位點屬于雜合突變，先證者弟弟(46，XY。未育)屬于純合突變，先證者妹妹(育有1女孩、1男孩)屬于雜合突變(圖2)。根據(jù)已有文獻報道，LHCGR 基因純合突變可導(dǎo)致EFS，可作為臨床上EFS診斷的一個分子指標。且根據(jù)以往研究報道，具有 LHCGR 基因突變的患者較難獲得卵子。本次檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者在 LHCGR 基因上存在純合突變，經(jīng)驗證符合孟德爾遺傳規(guī)律。該基因純合突變被高度懷疑是患者無卵母細胞及顆粒細胞的致病原因。

2.2 家系分析結(jié)果 對患者親本樣品的基因檢測分析(圖2)表明，父本和母本均為雜合突變，可生育后代；其中一位可生育后代的妹妹也是雜合子突變，而患者及其弟弟(46，XY)屬于純合突變，均未能生育后代；表明LHCGR在該位點雜合突變不影響生育后代，純合突變患者影響生育。在一個卵泡發(fā)育正常、E2水平和血漿人絨毛膜促性腺激素(hCG)水平在正常范圍內(nèi)的育齡婦女中，在重復(fù)周期中不能獲得卵母細胞的原因，可能是卵巢反應(yīng)不良或hCG注射失敗，也可能是某些基因缺陷導(dǎo)致。

T/C：雜合突變；C/C：純合突變。
圖2 LHCGR基因突變患者家系圖

3 討論

EFS是一種生殖障礙，盡管卵泡發(fā)育和E2水平明顯正常[1]，但在進行IVF治療過程中，對患者進行誘導(dǎo)排卵后反復(fù)抽吸和沖洗成熟的卵泡，也無法獲取卵母細胞[2]。根據(jù)取卵當天β-hCG的水平，將EFS分為“真”EFS(GEFS)和“假”EFS(FEFS)[3]。

關(guān)于GEFS發(fā)病機制知之甚少，但可能涉及特定的遺傳因素。曾有報道指出，與取回卵母細胞的患者相比，復(fù)發(fā)性EFS患者顆粒細胞中一些促凋亡基因的表達增加，其表達產(chǎn)物中負責正常卵泡生長的轉(zhuǎn)錄本(如PAPP-A，MAPK 3)明顯減少[4]。Onalan等[5]曾報道了兩個患有先天性耳聾的姐妹因不明原因不孕接受了三個IVF周期的病例：盡管她們卵巢反應(yīng)正常，取卵時血漿hCG水平也正常，但沒有取到卵母細胞或卵丘-冠狀復(fù)合體。當對她們進行第二次hCG注射時依然提取不到卵母細胞。Yariz等[6]通過研究同樣的兩個姐妹發(fā)現(xiàn)在編碼LHCGR的基因中發(fā)現(xiàn)了一個突變(p.N400S)，該突變與GEFS相關(guān)，并作為隱性性狀遺傳。這種突變導(dǎo)致了LH信號傳遞途徑的不可逆阻斷，這也解釋了為什么重復(fù)給藥hCG是無效的。另有研究人員提出EFS的危險因素與卵巢儲備不足相似，提示EFS病因可能包括卵巢老化[7]。

LHCGR是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)家族的成員[8]，主要表達在卵巢的卵泡膜細胞上，也存在于顆粒細胞(Granulosa cell, GC)和卵丘細胞(Cumulus cell, CC)上，特別是在接近排卵的優(yōu)勢卵泡中[9-10]。LHCGR主要通過G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶，增加環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平，導(dǎo)致PKA激活。通過蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)依賴的途徑持續(xù)激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)導(dǎo)致卵母細胞成熟，排卵和黃體生成[11]。LHCGR主要在性腺中表達，在E2的產(chǎn)生、排卵和黃體形成中起重要作用。

雖然以前認為具有LHCGR突變的婦女即使通過IVF治療，也沒有使用自己的卵母細胞從而獲得懷孕的機會，但最近有報道指出對該類患者進行雙重扳機和延長扳機與取卵間隔時間后，獲得了卵母細胞和高質(zhì)量胚胎，然后進行冷凍胚胎移植，其中一患者成功地生下了雙胞胎，另一患者成功產(chǎn)下一名男嬰[19]。這些患者除了卵母細胞獲取困難外，在體外受精、胚胎發(fā)育以及妊娠期均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。這是首次報道存在致病性LHCGR變異的婦女，通過輔助生殖技術(shù)治療后，成功的獲取卵母細胞進而獲得自己的孩子，也進一步闡明LHCGR突變雖干擾排卵，但對受精和胚胎發(fā)育沒有影響[19]。這也給存在致病性LHCGR變異的患者帶來了新的生育希望。

致謝：感謝復(fù)旦大學(xué)出生缺陷研究中心王磊教授團隊在患者血樣本基因檢測方面給予的幫助。