馬春蕾 宋韶清

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所；3 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生“腦中風(fēng)”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

耳鳴是在外界無聲源刺激情況下患者對聲音的一種虛擬感知，是一種聽錯覺。耳鳴的患病率高，一項(xiàng)大規(guī)模調(diào)查顯示成年人中約10.1%的人患有耳鳴，而且隨著年齡的增長耳鳴的發(fā)病率逐年增高[1]。

耳部疾病、噪聲損傷、神經(jīng)退變、藥物毒性均可導(dǎo)致耳鳴。在耳毒性藥物中，水楊酸類抗炎藥、氨基糖苷類抗生素和順鉑類抗癌藥導(dǎo)致耳鳴的發(fā)生率最高。耳鳴可以間歇性發(fā)作，也可長期持續(xù)存在。長期持續(xù)高響度的耳鳴可使患者極度痛苦，如失眠、記憶力下降、焦慮、抑郁，甚至自殺[2-5]。過去認(rèn)為，耳鳴是由聽覺感受部位的病變?nèi)缍伮犛X毛細(xì)胞受損，或聽神經(jīng)的病變導(dǎo)致的[6-7]，但是切斷聽神經(jīng)之后耳鳴不能消失[8]。近來發(fā)現(xiàn)耳鳴個體的聽覺中樞處于高興奮狀態(tài)，以至使聽覺過敏[9-10]。長時間的耳鳴可以改變聽覺中樞以及相關(guān)腦部的功能狀態(tài)[11]。

臨床上常使用鈉離子通道抑制劑如利多卡因、天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)抑制劑、苯二氮卓類藥物如安定、噪聲掩蔽等方法治療耳鳴，但療效均不理想。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor Yellow A，HSYA)能夠有效地緩解水楊酸鈉引發(fā)的小鼠耳鳴，發(fā)揮防治耳鳴的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與藥物治療 采用出生后7～8周聽力正常的C57BL/6雄性小鼠，利用聽覺驚跳(acoustic startle，AS)反應(yīng)配以前間隙抑制聽覺驚跳反應(yīng)(gap pre-pulse inhibition of the acoustic startle，GPIAS)篩選出無耳鳴的小鼠。選取24只小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只。第1組給予生理鹽水(normal saline，NS)0.4 mL腹腔注射；第2組給予水楊酸鈉(sodium salicylate，SS)(400 mg/kg)溶于NS 0.4 mL腹腔注射；第3組給予SS(400 mg/kg)聯(lián)合HSYA(20 mg/kg)溶于NS 0.4 mL腹腔注射，每日1次，連續(xù)3 d。完成最后一次給藥2 h后再次進(jìn)行AS反應(yīng)測試耳鳴發(fā)生情況。

1.2 行為學(xué)檢測 AS反應(yīng)配以GPIAS反應(yīng)(TDT，RZ6，美國)是檢測耳鳴是否存在的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。其實(shí)驗(yàn)原理是根據(jù)聽覺功能正常的動物在突然聽到很大的驚嚇聲音(115 dB)時反射性產(chǎn)生驚跳，這一現(xiàn)象被稱為AS反應(yīng)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)動物在接受持續(xù)的較低響度和不同頻率的窄帶噪聲(60 dB，SPL背景噪聲)刺激過程中嵌入一段無聲的間隙(gap)時，聽覺功能正常的小鼠能夠感知這一無聲間隙的出現(xiàn)因而產(chǎn)生警覺，對其后跟隨而來的較大聲音(115 dB，SPL)產(chǎn)生的驚跳反應(yīng)的幅度會大大地減小。但是，耳鳴小鼠，尤其是耳鳴的頻率與背景噪聲的頻率一致時，小鼠因自身耳鳴的存在不能辨別出gap的存在因而不會產(chǎn)生警覺，對隨后的較大的刺激聲音仍然產(chǎn)生很大幅度的驚跳。利用一個沒有嵌入無聲間隙的背景噪聲(no gap)和一個嵌入無聲間隙的背景噪聲(gap)作為背景刺激聲音的配對實(shí)驗(yàn)所獲得的小鼠AS反應(yīng)幅度之比來判斷小鼠是否存在耳鳴。實(shí)驗(yàn)中所給予的背景噪聲分別為8和16 kHz窄帶噪聲，帶寬為1 kHz，以了解耳鳴發(fā)生的頻率范圍。

所有小鼠在開始試驗(yàn)前連續(xù)3 d被放置在透明盒子中進(jìn)行適應(yīng)10 min。進(jìn)行GPIAS實(shí)驗(yàn)時，將每只小鼠放置在一個位于暗室的透明盒子中，透明盒子被放置在一個靈敏的壓電傳感器上，其產(chǎn)生的電壓與數(shù)字信號處理器產(chǎn)生的聲音所引起響應(yīng)的大小成正比。該平臺的輸出經(jīng)過放大、采樣、存儲于計(jì)算機(jī)內(nèi)，之后進(jìn)行離線分析。GPIAS由100次有前間隙試驗(yàn)(gap試驗(yàn))和100次無前間隙試驗(yàn)(no gap試驗(yàn))組成，有前間隙試驗(yàn)和無前間隙試驗(yàn)采用隨機(jī)配對法。耳鳴的程度以有前間隙的刺激所引出反應(yīng)的幅度與無前間隙的刺激所引出反應(yīng)的幅度之比的百分?jǐn)?shù)計(jì)算(Ratio = gap/no gap×100%)。

2 結(jié)果

2.1 SS引起小鼠耳鳴樣行為學(xué)改變 SS注射組小鼠在8 kHz AS反應(yīng)幅度之比明顯高于NS注射組的小鼠(P<0.005)。SS注射組在16 kHz AS反應(yīng)幅度之比也明顯高于NS注射組(P<0.005)，見表1，圖1。這一結(jié)果證明，SS注射組的小鼠存在耳鳴。

2.2 HSYA可有效地防止SS引起的耳鳴 接下來，我們分析了SS聯(lián)合HSYA注射組的小鼠的AS反應(yīng)檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SS聯(lián)合HSYA注射組的小鼠在8 kHz AS反應(yīng)幅度之比與SS組幅度相比雖然減小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在16 kHz，SS聯(lián)合HSYA注射組AS反應(yīng)幅度之比較SS注射組明顯降低(P<0.005)，見表1和圖1。SS聯(lián)合HSYA注射組在16 kHz所測得的AS反應(yīng)幅度之比明顯降低。這一結(jié)果提示，SS引起的小鼠耳鳴的頻率可能在16 kHz附近，而HSYA能夠有效地防止SS引發(fā)的小鼠耳鳴。

表1 各組AS反應(yīng)幅度之比

注：與NS注射組相比，***P<0.005；與SS注射組相比，###P<0.005；n=6。

A. SS注射組小鼠在8 kHz背景噪聲存在下的AS反應(yīng)幅度之比較NS注射組明顯提高(P<0.005)；SS聯(lián)合HSYA注射組小鼠的AS反應(yīng)幅度之比與單一注射SS組相比無明顯差異(P>0.05)；B. 在16 kHz，SS明顯提高AS反應(yīng)幅度之比，而SS聯(lián)合HSYA注射組小鼠AS反應(yīng)幅度之比顯著降低。***P<0.005。
圖1 AS反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示HSYA抑制或去除SS引起的耳鳴

3 討論

使用GPIAS方法檢測動物是否存在耳鳴時，實(shí)驗(yàn)流程簡單，數(shù)據(jù)客觀，還可了解耳鳴發(fā)生的頻率，是一種較可靠的耳鳴檢測方法。實(shí)驗(yàn)中我們采用GPIAS與AS相匹配的檢測方法，分別給小鼠8和16 kHz的窄帶噪聲作為背景刺激聲，可以了解小鼠耳鳴的頻率范圍。在小鼠耳鳴的頻率與所給的背景噪聲頻率一致的時候，小鼠由于自己耳鳴的頻率與背景噪聲頻率一致，就無法辨別背景噪聲中是否有無聲的間隙，也就不能對背景噪聲的變化產(chǎn)生警覺，故對隨后的驚嚇聲音的反應(yīng)幅度與背景噪聲中不含間隙時的AS反應(yīng)幅度相比無差別，故gap/no gap AS反應(yīng)幅度之比在理論上很接近，故比值接近100%。SS引起小鼠耳鳴，因此其比值大于NS注射組和SS聯(lián)合HSYA注射組。

HSYA，中藥紅花的提取物，在腦中風(fēng)動物模型顯示了有效的神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，HSYA能夠抑制NMDAR的活動，通過抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞NMDAR介導(dǎo)的病理性鈣超載和細(xì)胞死亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。由于耳鳴也是中樞神經(jīng)細(xì)胞過度興奮所致[15-17]，而且抑制NMDAR興奮性可以減輕耳鳴[7,18-19]。因此，我們試用HSYA防治SS引發(fā)的小鼠耳鳴，結(jié)果顯示HSYA具有極好的耳鳴防治作用。

SS注射組的小鼠產(chǎn)生了耳鳴，表現(xiàn)為gap/no gap AS反應(yīng)幅度之比明顯增大，甚至大于100%，其增大還可能涉及聽覺過敏等復(fù)雜因素。而NS注射的小鼠無耳鳴產(chǎn)生，其AS反應(yīng)幅度之比遠(yuǎn)小于100%。在SS聯(lián)合HSYA注射的小鼠，因SS致耳鳴的作用被HSYA極大地削弱，故其AS反應(yīng)幅度之比較單一SS注射組明顯減小。反之，該比值的減小也證明HSYA能夠防止SS引發(fā)耳鳴。

綜上所述，利用AS反應(yīng)和前刺激抑制的原理，我們驗(yàn)證了SS能夠可靠地引發(fā)小鼠耳鳴。SS和HSYA一并注射可以有效地防止小鼠耳鳴的發(fā)生。我們還發(fā)現(xiàn)，頻率無論是在8 kHz還是在16 kHz時SS引發(fā)小鼠耳鳴均較為明顯，而在16 kHz時HSYA顯示有抑制SS致耳鳴的作用。這一新發(fā)現(xiàn)將對臨床治療耳鳴開辟新的治療方法。