蘇文華 湯海青 歐昌榮 高亞文 張夢思 李亞敏 昝春蘭

(1寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315211;2浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校食品學(xué)院,浙江 寧波 315100)

大黃魚(Pseudosciaena crocea)肉質(zhì)細(xì)嫩,味道鮮美,深受消費者喜愛[1]。近年來,大黃魚產(chǎn)量不斷上升,2016 年產(chǎn)量已達(dá)到16.55 萬t[2]。大黃魚肉具有高水分、高蛋白和高脂肪的特點,在貯藏過程中易腐敗變質(zhì),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。冷藏是大黃魚銷售環(huán)節(jié)、貯藏過程中減緩腐敗變質(zhì)的有效方法之一,但冷藏過程中內(nèi)源酶仍有活性,魚肉中部分蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸在低溫下會發(fā)生氧化,降低大黃魚營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)價值[4]。且市場上以凍藏、長時間冷藏的水產(chǎn)品冒充新鮮水產(chǎn)品的現(xiàn)象屢見不鮮,普通消費者難以通過直觀鑒別。

鮮度是決定魚類品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,傳統(tǒng)的評價方法主要有感官、微生物、理化檢測等[5-7],但上述評價方法對檢測人員專業(yè)要求高,且操作繁瑣、難以實現(xiàn)實時檢測[8-10]。近年來,紅外[11]、拉曼[12]、高光譜成像[13]等光譜技術(shù)已被應(yīng)用于水產(chǎn)品鮮度的快速無損檢測,其中紅外光譜的應(yīng)用最為廣泛,但其對較高含水量魚類的定性分析精度不高[14],主要是由于水產(chǎn)品中含有較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光發(fā)色基團(tuán)[15],在貯藏、加工過程中,發(fā)色基團(tuán)會隨水產(chǎn)品組織結(jié)構(gòu)及生化特性的改變而發(fā)生變化。近年來,有研究者利用前表面熒光技術(shù)(front-face fluorescence spectroscopy,FFFS)檢測內(nèi)源熒光強(qiáng)度的變化,從而實現(xiàn)了對水產(chǎn)品鮮度的評價。如,Karoui 等[16]利用前表面熒光光譜法結(jié)合主成分分析,發(fā)現(xiàn)新鮮和凍融鱈魚之間有較明顯的區(qū)別;Hassoun 等[17]利用前表面熒光光譜法研究了不同儲存條件下鱈魚的鮮度變化,發(fā)現(xiàn)色氨酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)的熒光強(qiáng)度與硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)呈良好的相關(guān)性。與傳統(tǒng)熒光光譜法相比,前表面熒光光譜技術(shù)樣品處理簡單、檢測速度快、靈敏度高,可用于分析粉末狀、不透明的樣品[18]。但是前表面熒光光譜法在水產(chǎn)品鮮度評價方面的研究還不夠深入。為此本研究通過前表面熒光光譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)對不同冷藏時間的大黃魚進(jìn)行分析,并運用偏最小二乘回歸(partical least squares regression,PLSR)模型對大黃魚的冷藏時間進(jìn)行預(yù)測,以期為前表面熒光光譜在水產(chǎn)品鮮度評價中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品前處理

鮮活大黃魚購自寧波市水產(chǎn)批發(fā)市場,重450±50.0 g,體長35±5.0 cm,隨機(jī)選取50 尾,充氧運回實驗室后冰擊致死。將背部肌肉均勻分割成3 cm×2 cm×1 cm 的小塊,分裝于聚乙烯保鮮袋中,4℃冷藏。新鮮樣品20 個,經(jīng)不同冷藏時間處理的樣品每組10 個,分別于第0、第3、第5、第8 天進(jìn)行分析。

1.2 前表面熒光光譜數(shù)據(jù)采集

熒光光譜利用Horiba 公司的Fluoromax-4 熒光光譜儀測定。準(zhǔn)確稱取0.50 g 肉樣,置于固體支架配件中,調(diào)整入射角度為56°。檢測參數(shù):激發(fā)光源為150 W 氙弧燈;激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度均為1 nm;響應(yīng)時間設(shè)為自動;掃描光譜進(jìn)行儀器的自動校正;色氨酸殘基和NADH 激發(fā)波長分別為290 和340 nm,發(fā)射光譜分別為305 ～400 和360 ～600 nm。色氨酸和NADH 的熒光光譜數(shù)據(jù)各測50 組。

1.3 光譜數(shù)據(jù)歸一化處理

為消除光譜采集中操作方法對數(shù)據(jù)的干擾,減少光散射效應(yīng),參照Bertrand 等[19]的方法,對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。公式如下:

式中,N為每條光譜的數(shù)據(jù)點數(shù);Ci為i波長下的歸一化值;Li為i波長下的熒光強(qiáng)度。

1.4 回歸模型的建立

PLSR 是光譜分析中使用最多的一種建模方法[20]。試驗共有4 種處理樣本,每種處理樣本各隨機(jī)抽取3 個作為預(yù)測集,其余樣本作為建模集,建模集樣本共38 個,預(yù)測集樣本共12 個。建模集樣本的平均光譜和魚肉冷藏時間用PLSR 建模,模型再對預(yù)測集樣本的冷藏時間進(jìn)行預(yù)測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),Fisher 線性判別分析(fisher linear discriminant analysis,FLDA)和偏最小二乘回歸(PLSR),前兩種方法根據(jù)各自不同的原理對樣品進(jìn)行分類,后一種方法是采用數(shù)據(jù)降維、信息綜合與篩選技術(shù),提取對系統(tǒng)最佳解釋能力的新綜合成分,消除多個變量之間的共線性,最大化自變量與因變量之間的共線性,從而建立回歸模型。使用Orgin 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

光譜歸一化是將光譜統(tǒng)一到相同尺度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的方法[21]。為消除光譜采集中操作方法對測定數(shù)據(jù)的干擾,提高儀器靈敏度,增強(qiáng)樣品之間的差異性,對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。由圖1-A 可知,新鮮大黃魚色氨酸發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長在330 nm 處,冷藏大黃魚最大發(fā)射波長在328 nm 處,表明不同冷藏時間大黃魚的色氨酸發(fā)射光譜存在差異。

在發(fā)射光譜中最大熒光強(qiáng)度記為Imax,是熒光光譜的一個重要參數(shù),對色氨酸殘基所處環(huán)境的極性和熒光基團(tuán)的運動很敏感[22-23]。由圖1-B 可知,隨冷藏時間延長,大黃魚肉色氨酸最大熒光強(qiáng)度先降低后升高,第5 天時樣品出現(xiàn)最低熒光強(qiáng)度(Imax=0.160 58),第8 天時樣品出現(xiàn)最高熒光強(qiáng)度(Imax=0.162 63)。通常,冷藏過程中蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致色氨酸殘基所處微環(huán)境改變,造成大黃魚色氨酸最大熒光強(qiáng)度降低的主要原因是隨著冷藏時間延長蛋白質(zhì)發(fā)生變性,色氨酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于表面,所處的微環(huán)境極性增強(qiáng),色氨酸熒光量子產(chǎn)率降低,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降[24-26]。當(dāng)大黃魚冷藏8 d 后,Imax反而上升,這可能是暴露的疏水基團(tuán)間相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集,色氨酸殘基又重新被包埋于非極性環(huán)境所致[27]。

NADH 歸一化熒光光譜如圖2 所示,新鮮和不同冷藏時間大黃魚NADH 發(fā)射光譜均在375、451、465 和559 nm 處出現(xiàn)熒光峰。另外,514 ～541 nm 波段內(nèi),冷藏8 d 樣品的NADH 熒光強(qiáng)度高于新鮮樣品的熒光強(qiáng)度。Perlin 等[28]用熒光法測得NADH 激發(fā)波長為340 nm 時,發(fā)射波長在451 nm 附近;465 nm 處的熒光峰是醛和氨基酸反應(yīng)生成的熒光氧化產(chǎn)物所產(chǎn)生[29]。

雖然不同冷藏時間大黃魚的熒光強(qiáng)度有所差異,但其光譜曲線趨勢基本相同,很難通過光譜圖區(qū)分不同冷藏期的大黃魚。而化學(xué)計量學(xué)可最大限度地獲取相關(guān)數(shù)據(jù)信息[30],因此,采用前表面熒光光譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對不同冷藏時間大黃魚的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

圖1 大黃魚肉樣色氨酸歸一化熒光發(fā)射光譜Fig.1 Normalized fluorescence emission spectra of tryptophan in Pseudosciaena crocea muscle samples

2.2 基于熒光光譜的主成分分析

圖2 大黃魚魚肉樣品NADH 歸一化熒光發(fā)射光譜Fig.2 Normalized fluorescence emission spectra of NADH in Pseudosciaena crocea muscle samples

PCA 是將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計分析方法,對歸一化后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,使綜合指標(biāo)盡可能地代表原指標(biāo)的信息,且彼此間互不相關(guān),以解決譜帶重疊的問題[31-33]。通常,第一主成分圖像包含樣品絕大部分信息,第二主成分圖像包含的樣品信息少于第一主成分,累計貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上為宜[34]。由表1 可知,色氨酸熒光光譜前兩個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85%,包含了原始光譜的主要信息,以前兩個主成分得分繪制散點圖(圖3-A)。NADH 熒光光譜前三個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85%,為減少信息損失,以前三個主成分得分建立散點圖(3-B)。由圖3 可知,對不同冷藏時間處理的大黃魚樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后,色氨酸、NADH 熒光光譜均可區(qū)分不同冷藏時間的大黃魚,且前者的區(qū)分效果更好。但是不同冷藏時間的平行樣品較分散,需采用判別分析方法進(jìn)一步對樣品分類。

表1 大黃魚魚肉樣品中色氨酸、NADH 熒光光譜主成分分析結(jié)果Table 1 Results obtained in principal component analysis(PCA)of tryptophan and NADH fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

圖3 大黃魚魚肉樣品中色氨酸(A)、NADH(B)熒光光譜主成分分析得分圖Fig.3 Principal component analysis similarity map of tryptophan(A)and NADH(B)fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

2.3 Fisher 函數(shù)的建立和驗證

2.3.1 基于熒光光譜的Fisher 線性判別分析 FLDA的目的是使各個組間的重心距離最大且組內(nèi)差異最小,在充分保存現(xiàn)有信息的前提下,使同類數(shù)據(jù)間的差異性盡可能縮小,不同類數(shù)據(jù)間的差異盡可能擴(kuò)大[35]。由表2 可知,色氨酸熒光光譜數(shù)據(jù)獲得3 個典則判別函數(shù),其特征值為21.206、5.587、2.957,分別能解釋方差的71.3%、18.8%、9.9%;NADH 熒光光譜數(shù)據(jù)獲得3 個典則判別函數(shù),其特征值為50.905、27.589、1.929,分別能解釋方差的63.3%、34.3%、2.4%。由兩組光譜數(shù)據(jù)的判別結(jié)果可知,函數(shù)1 和函數(shù)2 的Wilk’s Lambda 值較小,且典型相關(guān)性較強(qiáng)(P＜0.001),因此函數(shù)1 與函數(shù)2 對模型判別效果極顯著。

色氨酸熒光光譜判別函數(shù)1 和函數(shù)2 方差累積貢獻(xiàn)率為90.1%;NADH 熒光光譜判別函數(shù)1 和函數(shù)2方差累積貢獻(xiàn)率為97.6%,均大于85%。根據(jù)典則判別函數(shù)得分繪制二維散點圖可知,色氨酸和NADH 判別函數(shù)得分圖類內(nèi)聚情況較為集中(圖4),因此FLDA的區(qū)分效果優(yōu)于PCA。

2.3.2 Fisher 線性判別函數(shù)分析結(jié)果 判別函數(shù)的區(qū)分能力通過Leave-one-out 進(jìn)行交叉驗證。交叉驗證是一種重要的判別效果驗證方法,Leave-one-out 的優(yōu)點是每一個樣本都可作為校正集和預(yù)測集。由表3可知,色氨酸和NADH 熒光光譜總的判別正確率分別為100%和98%,說明判別模型可靠。

圖4 大黃魚魚肉樣品中色氨酸(A)、NADH(B)判別函數(shù)得分圖Fig.4 Scatter plot of canonical discriminant functions of tryptophan(A)and NADH(B)fluorescence emission spectra in Pseudosciaena crocea muscle samples

表3 交叉驗證集判別分析結(jié)果Table 3 Results obtained in the discriminant analysis of the cross validation

2.4 熒光光譜數(shù)據(jù)與貯藏時間的PLSR 模型的建立

對大黃魚魚肉樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)和冷藏時間建立PLSR 模型,考察前表面熒光光譜區(qū)分不同冷藏時間大黃魚的可行性。評價模型質(zhì)量的主要指標(biāo)有校正集相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of calibration,Rc)、預(yù)測集相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of prediction,Rp)、校正均方根誤差(root mean square error of calibration,RMSEC)、預(yù)測均方根誤差(root mean square error of prediction,RMSEP)和交互驗證均方根誤差(root mean square error of cross validation,RMSECV)等。通常相關(guān)系數(shù)越接近1,RMSEC 和RMSEP 越小且越接近,或者RMSECV 越小,模型的預(yù)測能力越好[36]。由表4 可知,色氨酸和NADH 光譜的校正集和預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)均大于0.9,且RMSEC 和RMSEP 均小于1;色氨酸和NADH 熒光光譜的RMSECV 分別為1.13 和0.41,說明模型的預(yù)測能力較好。由圖5 可知,樣本均分布于回歸線周圍,且距回歸線較近,說明建立的模型較好。因此,前表面熒光光譜法結(jié)合PLSR 可用于預(yù)測冷藏大黃魚的貨架期。

3 討論

近幾年,多種光譜技術(shù)已應(yīng)用于水產(chǎn)品鮮度的鑒別,但在實際研究中,紅外光譜對環(huán)境要求較嚴(yán)格,而拉曼光譜信號受熒光干擾使得測量精確度和重復(fù)性不佳,高光光譜數(shù)據(jù)冗余嚴(yán)重、成本昂貴[14,37-39]。熒光光譜與其他光譜技術(shù)相比,靈敏度高、檢測費用低、檢測速度快。但要實現(xiàn)光譜技術(shù)由實驗室分析階段向在線分析方向的發(fā)展,就必須以大量基礎(chǔ)研究及前期應(yīng)用作支撐,因此,建立快速、無損、準(zhǔn)確的測定大黃魚冷藏時間的方法,對實現(xiàn)大黃魚冷藏時間的評定具有重要的現(xiàn)實意義。

表4 光譜數(shù)據(jù)與冷藏時間的PLSR 模型Table 4 PLSR model of correlating between spectral measurement and refrigerated time

圖5 大黃魚魚肉冷藏時間的預(yù)測值與實測值Fig.5 Reference vs predicted storage time for Pseudosciaena crocea muscle

王守業(yè)等[40]研究發(fā)現(xiàn)色氨酸殘基在290 nm 處被激發(fā)后,于325 ～350 nm 范圍內(nèi)出現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度;Dufour 等[41]利用前表面熒光光譜法鑒定鱈魚、鯖魚和三文魚鮮度時發(fā)現(xiàn),色氨酸發(fā)射光譜的最大熒光強(qiáng)度在336 nm 處,這與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn),新鮮與冷藏大黃魚的色氨酸發(fā)射光譜存在差異,冷藏樣品和新鮮樣品相比熒光光譜發(fā)生輕微藍(lán)移,這可能與色氨酸殘基結(jié)構(gòu)或所處的微環(huán)境發(fā)生改變有關(guān)[18]。Hassoun 等[17]利用前表面熒光檢測鱈魚的色氨酸光譜時發(fā)現(xiàn),冷藏期鱈魚的熒光光譜發(fā)生紅移,與本研究結(jié)果不一致,可能是試驗材料不同所致,本研究選用的是多脂的大黃魚而鱈魚屬于低脂魚類。

此外,大黃魚肉在冷藏期間色氨酸最大熒光強(qiáng)度先降低后升高,冷藏5 d 時樣品出現(xiàn)最低熒光強(qiáng)度(0.160 58),冷藏8 d 時樣品出現(xiàn)最高熒光強(qiáng)度(0.162 63)。Hassoun 等[17]利用前表面熒光光譜法研究冷藏條件下鱈魚的色氨酸光譜時發(fā)現(xiàn),新鮮樣品出現(xiàn)最高熒光強(qiáng)度,而冷藏8 d 時樣品出現(xiàn)最低熒光強(qiáng)度,本研究在冷藏前期熒光強(qiáng)度也呈下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)在514～541 nm 波段內(nèi),冷藏8 d 樣品的NADH熒光強(qiáng)度高于新鮮樣品,但Dufour 等[41]利用前表面熒光光譜法研究鯖魚的NADH 熒光光譜時發(fā)現(xiàn),在此波段范圍冷藏8 d 樣品的熒光強(qiáng)度低于冷藏1 d 的樣品;Olsen 等[42]利用前表面熒光光譜法結(jié)合動態(tài)頂空/氣相色譜-質(zhì)譜法研究鮭魚鮮度時發(fā)現(xiàn),熒光強(qiáng)度與脂肪氧化程度呈正相關(guān)。這可能是由于大黃魚屬于多脂魚,在冷藏過程中,魚肉脂肪氧化產(chǎn)物與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、磷脂、核酸、脫氧核糖等相互作用,產(chǎn)生熒光性物質(zhì),導(dǎo)致樣品的熒光強(qiáng)度升高[43]。

本研究結(jié)果表明,色氨酸、NADH 熒光光譜均可以實現(xiàn)對不同冷藏時間大黃魚的區(qū)分,且前者的區(qū)分效果更好,但高亞文等[44]發(fā)現(xiàn)NADH 熒光光譜對樣品的區(qū)分效果更好,這是因為NADH 的熒光強(qiáng)度與其含量有關(guān),其含量高低又取決于β-羥基酰輔酶A 去氫酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,HADH)的活性。有研究表明,利用HADH 酶活性區(qū)分新鮮、冷藏和凍融樣品時發(fā)現(xiàn),凍融樣品的酶活性最大,新鮮與冷藏樣品中HADH 酶活性差異不明顯[45-47],因此NADH 熒光光譜更適用于區(qū)分新鮮與凍融樣品。特征光譜結(jié)合FLDA 對不同冷藏時間大黃魚的區(qū)分效果優(yōu)于主成分分析。畢夏坤等[48]利用便攜式近紅外光譜儀判別雞蛋的貯藏時間時發(fā)現(xiàn),特征光譜結(jié)合FLDA 的區(qū)分效果優(yōu)于PCA,這是因為FLDA 考慮了類間的差異,并將其最大化,所以區(qū)分效果較好。

近年來光譜分析技術(shù)已被應(yīng)用于水產(chǎn)品的冷藏時間預(yù)測,如Nilsen 等[49]建立了可見近紅外預(yù)測鱈魚和鮭魚冷藏時間的PLSR 模型,RMSECV 分別為1.04 和1.20;Sivertsen 等[50]建立了高光譜預(yù)測鱈魚冷藏時間的PLSR 模型,RMSECV 為1.88。本研究建立的冷藏時間預(yù)測模型中,色氨酸和NADH 的RMSECV 分別約為1.13、0.41,且RMSEC/RMSEP 分別約為0.53、0.99,RMSECV 較小,RMSEC/RMSEP 均小于1 且接近,說明前表面熒光光譜法結(jié)合PLSR 模型可用于預(yù)測魚肉的冷藏時間,且NADH 的預(yù)測效果相對較好。但仍需通過擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗證模型的穩(wěn)定性以提高模型整體的可靠性及預(yù)測精度。

4 結(jié)論

色氨酸和NADH 是細(xì)胞內(nèi)兩種重要的內(nèi)源熒光物質(zhì),前表面熒光光譜法作為一種無損檢測技術(shù)能夠快速地從大黃魚中提取色氨酸和NADH 光譜信息,可為水產(chǎn)品品質(zhì)評價提供依據(jù)。利用PCA 和FLDA 均可區(qū)分新鮮和不同冷藏時間的大黃魚,但是后者的區(qū)分效果優(yōu)于前者。根據(jù)不同冷藏時間魚肉的色氨酸和NADH 熒光光譜,用校正集樣本的光譜數(shù)據(jù)與冷藏時間建立PLSR 模型,對樣本的冷藏時間有較好的預(yù)測;在定性區(qū)分上(PCA、FLDA),以色氨酸為熒光探針效果較好,在冷藏時間的定量預(yù)測上,以NADH 為熒光探針預(yù)測效果更好。前表面熒光光譜法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)技術(shù)可用于鑒定水產(chǎn)品冷藏時間。本研究結(jié)果為前表面熒光光譜在水產(chǎn)品鮮度評價中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。