楊 開 周 城 楊振寰 虞 嵐 孫培龍

(1浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 杭州 310014;2舟山市越洋食品有限公司,浙江 舟山 316000)

海捕蝦滋味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,是廣大居民日常食用的重要水產(chǎn)品。但是蝦類采捕季節(jié)集中,蝦中含水量高,極易腐敗變質(zhì)[1],漁民往往采用焦亞硫酸鈉進(jìn)行保鮮處理,而保鮮操作的不當(dāng)以及焦亞硫酸鈉過量使用,使得處理后的海捕蝦中二氧化硫殘留量嚴(yán)重超標(biāo)[2-3]。自20 世紀(jì)80 年代起,亞硫酸鹽的安全問題引起越來越多的關(guān)注[4-5]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明,過量攝入二氧化硫會(huì)刺激呼吸道[6],引起敏感人群的哮喘和過敏反應(yīng)[7-8]。此外,長(zhǎng)期接觸亞硫酸鹽會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性[9],甚至對(duì)生殖系統(tǒng)造成損害[10-11]。由于人體內(nèi)含有少量的亞硫酸鹽氧化酶[12],能夠氧化亞硫酸鹽,經(jīng)正常解毒后,通過尿液排出,因此攝入少量亞硫酸鹽是安全無害的[13]。為了規(guī)范亞硫酸鹽類添加劑合理使用,國(guó)際食品法典委員會(huì)(codex alimentarius commission,CAC)規(guī)定生蝦仁和熟蝦仁的亞硫酸鹽限量分別為100 mg·kg-1和30 mg·kg-1。我國(guó)《GB 2760-2014 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[14]也明確規(guī)定蝦仁中亞硫酸鹽殘留量不得超過100 mg·kg-1(殘留量以SO2計(jì)),生食用鮮魚、貝類等則禁止使用。

目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品中二氧化硫的脫除技術(shù)報(bào)道比較少,主要集中在果酒發(fā)酵方面,如在葡萄酒生產(chǎn)過程利用離子交換柱吸附,而有關(guān)水產(chǎn)品的脫二氧化硫技術(shù)鮮有報(bào)道。蝦仁脫硫工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的方法為多次水循環(huán)處理和熱風(fēng)處理,但該方法效率不高,且耗水、耗能大。有研究表明能與蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)合[16],此外亞硫酸鹽可還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵[17]。而酪蛋白因其良好的物質(zhì)特性和經(jīng)濟(jì)性能,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),常作為水產(chǎn)肉糜制品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、乳化穩(wěn)定劑、載體等。本研究?jī)?yōu)化了酪蛋白溶液對(duì)蝦仁中亞硫酸鹽的脫除工藝,并初步探討其脫除機(jī)理,旨在為降低蝦仁的亞硫酸鹽殘留和品質(zhì)控制提供保障,也為其他水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的脫除提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海捕中華管鞭蝦仁(Solenocera melantho),由舟山市越洋食品有限公司提供,-18℃冷凍儲(chǔ)存。酪蛋白[生物試劑(biochemical reagent,BR)],購自上海麥克林試劑有限公司;食品級(jí)碳酸氫鈉,購自湖南海聯(lián)三一小蘇打有限公司;亞硫酸鈉、乙酸鉛、碘、碘化鉀、溴化鉀、淀粉等均為分析純,購自上海凌峰試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TA.XT Express 型物性測(cè)試儀,北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司;UV-245 型紫外-可見分光光度計(jì),日本島津公司;Bechman Allegra 型冷凍離心機(jī),日本日立公司;BTP-3XL 型冷凍干燥機(jī),美國(guó)SP Scientific 公司;Nicolet 6700 型傅里葉紅外光譜儀,美國(guó)Thermo 公司;全玻璃蒸餾裝置,江蘇康達(dá)玻璃儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝦仁脫硫預(yù)處理 冷凍蝦仁→4℃靜水解凍→置于三層吸水紙,拭去表面水分→稱取50 g 體形相似的蝦仁,用于酪蛋白溶液浸泡脫硫試驗(yàn),其中酪蛋白溶液用1 g·L-1食品級(jí)NaHCO3溶液配制[14],并以1 g·L-1NaHCO3溶液處理為對(duì)照→經(jīng)脫硫處理的蝦仁用4℃清水沖洗1 min→置于三層吸水紙,拭去表面水分→處理完的蝦仁用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 二氧化硫的測(cè)定 亞硫酸鹽以二氧化硫計(jì),參考GB 5009.34-2016 食品中二氧化硫的測(cè)定[18]中的碘滴定法。稱取蝦仁樣品5.0 g,置于蒸餾燒瓶中,加入250 mL 水,10 mL 鹽酸溶液(1∶1),加熱蒸餾45 min,蒸餾氣體用25 mL 20 g·L-1的乙酸鉛溶液吸收,吸收液用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液顏色變藍(lán)且30 s 內(nèi)不褪色,記錄消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)液體積,每組樣品平行測(cè)定3 次,且做空白試驗(yàn)。按照公式計(jì)算二氧化硫含量:

式中,X為蝦仁中二氧化硫總含量(以SO2計(jì)),g·kg-1;V為滴定樣品所用碘標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;V0為空白試驗(yàn)碘標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;c為碘標(biāo)準(zhǔn)液濃度,mol·L-1;m為蝦仁試樣質(zhì)量,g。

式中,X0為蝦仁解凍后的亞硫酸鹽含量(以SO2計(jì)),g·kg-1;X1為蝦仁浸泡處理后亞硫酸鹽的含量(以SO2計(jì)),g·kg-1。

1.3.3 蝦仁TPA(texture profile analysis)質(zhì)構(gòu)分析 選取大小相似的蝦仁,從腹背取第2 腹節(jié)蝦肉進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析[19]。采用物性測(cè)試儀對(duì)樣品的硬度、彈性、粘聚性和咀嚼性進(jìn)行測(cè)試。具體測(cè)試參數(shù)設(shè)置:P/36R柱形探頭,測(cè)試前速度3.0 mm·s-1,測(cè)試速度1.0 mm·min-1,測(cè)試后速度3.0 mm·min-1,測(cè)試形變量50%,觸發(fā)力5 g。測(cè)試至少5 個(gè)平行樣。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)定基礎(chǔ)條件:浸泡溫度4℃,料液比1∶8 g·mL-1,浸泡時(shí)間2 h,酪蛋白濃度0.5 g·L-1。固定其他條件,分別考察酪蛋白濃度(0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g·L-1)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10 g·mL-1)、浸泡時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)對(duì)亞硫酸鹽脫除率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,利用響應(yīng)面軟件,進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理,確定最佳工藝,且比較最佳工藝處理前后的品質(zhì)變化。以亞硫酸鹽殘留量為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平及編碼如表1 所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.3.6 Na2SO3與酪蛋白溶液體系的UV 分析 取0.5 mL 酪蛋白溶液(0.2 g·L-1)于試管中,分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL Na2SO3溶液(0.05 mol·L-1),并添加去離子水至5 mL,混勻,靜置10 min。然后以酪蛋白溶液為空白對(duì)照,在190 ～400 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其UV 吸收光譜[20]。

1.3.7 Na2SO3與酪蛋白反應(yīng)產(chǎn)物的FT-IR 分析 預(yù)處理過程:分別取100 mL 酪蛋白溶液(0.2 g·L-1)于燒杯中,分別添加0、0.05 g 無水Na2SO3,攪拌2 h 后,8 000×g離心10 min,收集沉淀產(chǎn)物,-70℃凍干。取凍干樣品1～2 mg,與100 mg 無水溴化鉀混合研磨,壓片后用傅立葉紅外光譜儀記錄酪蛋白、Na2SO3以及反應(yīng)產(chǎn)物在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收特征[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Box-Behnken Design 試驗(yàn)設(shè)計(jì)由Design-expert 8完成并作統(tǒng)計(jì)分析,其余數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.5、SPSS 22 統(tǒng)計(jì)分析軟件,試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 ～5 次重復(fù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并采用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性分析,以P＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦仁原料中亞硫酸鹽含量測(cè)定

經(jīng)測(cè)定,蝦仁原料的亞硫酸鹽含量為87.13 mg·kg-1(以SO2計(jì))。

2.2 單因素對(duì)亞硫酸鹽脫除率的影響

2.2.1 酪蛋白溶液濃度對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響

由圖1 可知,較低濃度的酪蛋白溶液對(duì)亞硫酸鹽的脫除效果已有明顯的提高。隨著酪蛋白濃度逐漸增加,脫除率隨之提高。當(dāng)酪蛋白濃度達(dá)到1.0 g·L-1時(shí),脫除率達(dá)到81.38%。當(dāng)濃度繼續(xù)升高,脫除率幾乎無變化,這可能存在兩種原因,一是酪蛋白的溶解度有限,試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)酪蛋白的添加量大于1.5 g·L-1時(shí),有少量酪蛋白不能完全溶解;二是剩余的亞硫酸鹽與蝦仁中某些成分結(jié)合比較牢固,不能被酪蛋白結(jié)合脫除。

圖1 酪蛋白溶液濃度對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響Fig.1 Effect of casein concentration on the removal of rate sulfites

2.2.2 液料比對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響 由圖2可知,酪蛋白溶液用量增加,浸泡體系中酪蛋白含量也相應(yīng)升高,亞硫酸鹽的可結(jié)合物增多,亞硫酸鹽脫除率升高。對(duì)照組隨著料液比增大,脫除率同樣有所提高,但變化沒有試驗(yàn)組明顯。因此適當(dāng)增大酪蛋白溶液的體積有利于脫除亞硫酸鹽。當(dāng)料液比1∶8 g·mL-1時(shí),脫除率最高(78.33%),相較對(duì)照組的脫除率(63.97%)有很大提高。

2.2.3 浸泡時(shí)間對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響 由圖3 可知,在浸泡2 h 內(nèi)是亞硫酸鹽溶出的主要過程,之后溶出速率下降,直至趨于平衡,浸泡3 h 時(shí),脫除率達(dá)到最大(79.03%)。對(duì)照組中由于最初濃度差大,蝦仁中的亞硫酸鹽迅速擴(kuò)散到浸泡液中,隨著濃度差逐漸平衡,擴(kuò)散速度趨于平緩。而對(duì)于酪蛋白溶液的浸泡體系,除與濃度差相關(guān),還可能與氫鍵作用力、離子作用力、化學(xué)反應(yīng)等有關(guān),使得Na2SO3的溶出速率大大提高,其具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖2 液料比對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on removal rate of sulfites

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)亞硫酸鹽脫除效果的影響Fig.3 Effect of time on the removal rate of sulfites

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)面分析三因素三水平對(duì)亞硫酸鹽的脫除條件進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。以亞硫酸鹽脫除率(%)為響應(yīng)值,經(jīng)回歸擬合,得到各因素的擬合方程:

脫除率(%)= 79.90+4.93X1+7.31X2+1.85X3-0.6X1X2-2.20X1X3-0.12X2X3-4.41X12 -4.04X22 -1.09X32。

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型方差分析 由表3 可知,響應(yīng)面方差分析中料液比(X1)和時(shí)間(X2)的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均極顯著,酪蛋白溶液濃度(X3)的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均未達(dá)到顯著水平,三因素的交互項(xiàng)也均不顯著。擬合亞硫酸鹽脫除率模型差異顯著(P=0.000 4),且失擬項(xiàng)(P＞0.05),二次回歸模型決定系數(shù)R2為0.959 8,說明試驗(yàn)結(jié)果可靠,回歸模型擬合度好,可以很好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。對(duì)所建立的回歸方程模型進(jìn)行最優(yōu)化分析,得到蝦仁中亞硫酸鹽脫除的最佳條件:酪蛋白溶液濃度1.30 g·L-1,浸泡時(shí)間2.37 h,料液比1∶6.8 g·mL-1,在此條件下亞硫酸鹽的理論脫除率為84.44%。以此條件做驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得亞硫酸鹽實(shí)際脫除率為84.13%,與預(yù)測(cè)值相比無顯著差異。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and test results

2.3.3 蝦仁質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果 經(jīng)最優(yōu)條件處理后的蝦仁樣品,通過TPA 測(cè)試儀測(cè)定其品質(zhì)變化,結(jié)果如表4所示。經(jīng)酪蛋白溶液浸泡處理后硬度和咀嚼性提高,這可能是由于酪蛋白溶液中含有少量的碳酸氫鈉[22],彈性和粘聚性的變化則不明顯。綜合比較發(fā)現(xiàn),酪蛋白溶液浸泡后蝦仁依然保持較好的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

2.4 Na2SO3 與酪蛋白溶液體系的UV 分析

“酪蛋白+Na2SO3”體系隨著Na2SO3濃度變化的UV 光譜圖(以酪蛋白純?nèi)芤簽閰⒈?如圖4 所示。有兩個(gè)電子躍遷帶,即200 ～230 nm 處的π→π*躍遷和280～310 nm 處的n→π*躍遷[20]。由圖4 可知,隨著酪蛋白溶液中Na2SO3的濃度增加,230 nm處的最大吸收峰強(qiáng)度增加并且伴隨著紅移,其最大吸收峰從230 nm 紅移至238 nm。這說明酪蛋白溶液使得的紫外最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移,π→π*躍遷變得困難,酪蛋白表面的電子偏向SO32-的硫原子,使之形成更大的共軛體系,導(dǎo)致SO32-中π→π*所需要的能量增加。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the response surface regression model

表4 處理前后蝦仁TPA 質(zhì)構(gòu)分析(n=5)Table 4 Determination of TPA before and after treatment(n=5)

圖4 不同濃度Na2SO3 與酪蛋白溶液體系的UV 光譜圖Fig.4 Absorption spectra changes at various concentrations of casein + Na2SO3

2.5 Na2SO3、酪蛋白以及反應(yīng)產(chǎn)物的FT-IR 分析

由圖5 可知,酪蛋白在與Na2SO3反應(yīng)后,FT-IR光譜發(fā)生了明顯的變化,各處的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng),且圖譜中出現(xiàn)3 個(gè)新的吸收峰,即1 117.18、970.20和626.06 cm-1,這3 個(gè)峰分別歸屬于S-O 鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)、不對(duì)稱伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng),并且與磺酸基團(tuán)最為接近[23]。因此,推測(cè)SO32-破壞了酪蛋白中的二硫鍵,生成RS-SO3H。此外,吸收Na2SO3后的酪蛋白在3 295.21、1 401.03 cm-1處吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng),研究表明,該處是氨基酸羧酸鹽的特征吸收峰之一[21],表明酪蛋白部分羧基形成了羧酸鹽。處理后的酪蛋白在酰胺Ⅰ帶(1 700 ～1 600 cm-1)和酰胺Ⅱ帶(1 600 ～1 500 cm-1)的吸收峰都明顯增強(qiáng),說明酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[24-25]。

圖5 酪蛋白結(jié)合Na2SO3 的FT-IR 光譜Fig.5 FT-IR spectra of Casein + Na2SO3

3 討論

食品中脫除亞硫酸鹽的方法大體可分為化學(xué)結(jié)合法、物理脫除法、氧化還原法和生物酶法等[26-27],每種方法各有優(yōu)勢(shì)。研究表明與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基存在分子間相互作用[16],本研究利用酪蛋白與結(jié)合,脫除蝦仁中的亞硫酸鹽,脫除率達(dá)到84.13%,優(yōu)于徐慧等[28]用清水沖洗、熱水蒸煮等物理預(yù)處理方法的效果,但是略低于廖妙飛等[29]采用輻照法的結(jié)果。Lin 等[15]采用冰草葉綠體粗制劑脫除葡萄酒中的亞硫酸鹽,其脫除率為93.00%;黃國(guó)平等[30]提取的水稻幼苗粗葉綠體對(duì)亞硫酸鹽的脫除效率達(dá)到94.58%。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,酪蛋白溶液處理能有效提高蝦仁中亞硫酸鹽的脫除率,雖然不及輻照方法和生物酶法的脫除效率,但是酪蛋白的安全性更高,成本更低。

本研究中,酪蛋白和Na2SO3溶液體系的紫外吸收光譜和紅外光譜研究表明,兩者之間除存在化學(xué)反應(yīng)之外,可能還存在相互作用,如范德華力、氫鍵、靜電作用力等,但本試驗(yàn)未深入研究。高飛[20]研究表明中的共軛體系受影響時(shí),會(huì)使其紫外最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移。本研究顯示,酪蛋白溶液中的吸收峰發(fā)生明顯藍(lán)移,說明其共軛體系可能被破壞,兩者之間存在相互作用。此外,徐敏[16]利用熒光法研究發(fā)現(xiàn),二氧化硫及其衍生物能通過疏水作用力和靜電作用力與人血清蛋白的氨基酸殘基(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)結(jié)合,從而淬滅蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光。本研究中酪蛋白的紅外光譜測(cè)定結(jié)果與Sun 等[31]和Holt 等[32]的結(jié)果相似,但本研究還表明,經(jīng)Na2SO3處理的酪蛋白,其結(jié)果發(fā)生變化,二硫鍵被破壞,并形成RS-SO3H。

4 結(jié)論

本研究探討了酪蛋白溶液脫除蝦仁中亞硫酸鹽殘留的可能性,結(jié)果表明,在4℃條件下,浸泡時(shí)間2.37 h,料液比1∶6.8 g·mL-1,酪蛋白濃度1.30 g·L-1,蝦仁中亞硫酸鹽脫除效果最佳,實(shí)際脫除率達(dá)到84.13%,處理后的蝦仁能保持較好的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。在傳統(tǒng)的研究食品中亞硫酸鹽脫除方法之外,探索了一個(gè)新的方向,酪蛋白溶液作為食品添加劑,處理安全性高,并能有效脫除蝦仁中的亞硫酸鹽殘留,可為其他含硫食品中亞硫酸鹽的脫除提供借鑒,在工業(yè)領(lǐng)域有潛在的商業(yè)應(yīng)用。對(duì)脫除機(jī)理的初步研究發(fā)現(xiàn),SO32-和酪蛋白分子之間可能存在相互作用,導(dǎo)致的電荷環(huán)境改變,使其紫外最大吸收峰發(fā)生藍(lán)移。此外,FI-TR 光譜表明,能將酪蛋白中的二硫鍵還原,生成磺酸鹽。本研究尚未對(duì)SO32-和酪蛋白分子的相互作用類型進(jìn)行深入研究,未能闡明其結(jié)合類型,結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合動(dòng)力學(xué)等微觀機(jī)理,后續(xù)在這方面的深入研究有助于開發(fā)更高效的亞硫酸鹽脫除劑。