尚珂含 楊舒婷 卞詩村 劉夢婷 安亞虹 王廣龍 熊愛生

(1淮陰工學(xué)院,江蘇淮安 223003;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210095)

水孔蛋白(aquaporins,AQPs)又稱水通道蛋白,是主要內(nèi)在蛋白(major intrinsic protein,MIP)超家族中的一個(gè)大家族,可以促進(jìn)包括水以及其他小分子物質(zhì)經(jīng)由生物膜的運(yùn)輸[1]。高等植物的水孔蛋白可分為五類,分別是質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic protein,PIP)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic protein,TIP)、小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(small and basic intrinsic protein,SIP)、類Nod26 膜內(nèi)在蛋白(nodulin 26-like intrinsic protein,NIP)和X 固有蛋白(X intrinsic proteins,XIP)[2]。PIPs 是一類定位于質(zhì)膜上的水孔蛋白。PIPs 不僅與植物水分、小分子物質(zhì)傳輸有關(guān),還參與植物應(yīng)對非生物脅迫的進(jìn)程[3]。在結(jié)構(gòu)上,PIPs蛋白具有MIP 家族典型的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)特征,即5 個(gè)短環(huán)(loopA ～loopE)連接的6 個(gè)跨膜α-螺旋(TM1 ～TM6),在B 環(huán)和E 環(huán)上含有高度保守的氨基酸基序NPA(Asn-Pro-Ala),這兩個(gè)NPA 基序?qū)τ谒ǖ佬纬善鹬陵P(guān)重要的作用[4]。根據(jù)序列特征可將PIPs 分為PIP1 和PIP2 兩大類。PIP2 類的N 端比PIP1 類短,而其C 端比PIP1 類長,這可能是導(dǎo)致兩者功能不完全相同的原因[5]。研究表明,PIP2 類蛋白一般具有很高的水分運(yùn)輸活性,而PIP1 類蛋白活性則較低或不具有活性,當(dāng)兩者同時(shí)表達(dá)時(shí),其活性和細(xì)胞膜通透性比PIP2 類單獨(dú)作用時(shí)高[6-7]。

目前,PIP2 基因在許多植物中已經(jīng)被克隆或鑒定,其在幾乎所有組織中均可表達(dá),同時(shí)容易受到高溫、干旱、鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn),從水稻中分離的OsPIP2;1 可通過調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸效率和根系生長響應(yīng)干旱脅迫[8];月季中的RhPIP2;1 參與了乙烯介導(dǎo)的花瓣擴(kuò)展,且該基因受到轉(zhuǎn)錄因子PTM 的調(diào)節(jié)[9-10];葡萄根特異表達(dá)的VvPIP2;4N可以調(diào)節(jié)根系導(dǎo)水性和葉片氣體交換速率[11];在草莓中克隆的3 個(gè)PIP2 基因在不同組織中均可以表達(dá),且可能參與草莓果實(shí)發(fā)育和成熟過程[12]。這些結(jié)果說明,PIP2 基因在植物生長發(fā)育和抵御非生物脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。芹菜(Apium graveolensL.)屬傘形科芹屬蔬菜作物,含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),在世界各地普遍栽培。隨著高溫、干旱等極端氣候頻繁發(fā)生以及土壤鹽漬化等問題的加劇,芹菜等園藝作物的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重的威脅[13-16]。如何增強(qiáng)植株抗逆能力,提高作物對逆境的適應(yīng)能力成為育種專家和農(nóng)業(yè)技術(shù)人員關(guān)注的焦點(diǎn)。本試驗(yàn)以芹菜品種六合黃心芹為研究材料,克隆獲得AgPIP2;1 基因,利用生物信息學(xué)工具對該基因進(jìn)行序列分析,并對其在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)和功能進(jìn)行分析,以期為芹菜等作物抗逆育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)材料為芹菜品種六合黃心芹,該品種是南京六合地區(qū)的優(yōu)良品種,因具有產(chǎn)量高、商品性好、品質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),深受廣大群眾歡迎[17]。將芹菜植株種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室,待植株2 月齡時(shí),分別對其進(jìn)行高溫(38℃)、低溫(4℃)、干旱(20%PEG 6000)以及鹽(200 mmol·L-1NaCl)的非生物脅迫處理,分別于處理0、1、2、4、8 和24 h 各選取5 株植株的頂部第2 ～第3 片葉,并取同時(shí)期未經(jīng)任何處理的根、葉柄和葉片,用于RNA 的提取及cDNA 的合成。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

1.2 主要試劑與工具酶

ExTaq聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa生物工程公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國Omega 公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 芹菜AgPIP2;1 基因的克隆

根據(jù)芹菜基因組數(shù)據(jù)庫[18],檢索并拼接出芹菜水孔蛋白基因AgPIP2;1 序列,設(shè)計(jì)一對克隆引物PIP-F(ACAAATTATCCATACCAACTCTGCT)和PIP-R(CTT GTCTTCCATAAATACTTTCTTG),以六合黃心芹cDNA作為PCR 反應(yīng)模板,PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,共40 個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。目標(biāo)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,回收后將產(chǎn)物連入pMD19-T載體(大連TaKaRa 生物工程公司),并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技(北京)有限公司],挑選陽性克隆并進(jìn)行PCR 鑒定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析

測序結(jié)果用NCBI BLAST(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對。采用ProtParam(https:/ /web.expasy.org/protparam/)對氨基酸成分、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)疏水性/親水性等進(jìn)行分析;利用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多重序列比對;使用MEGA 5 構(gòu)建進(jìn)化樹;采用在線軟件Softberry 對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測;采用SOPMA 預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu);利用在線軟件TMHMM(http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對AgPIP2;1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;通過Swiss-Model 在線軟件(http:/ /swissmodel.expasy.org)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.5 AgPIP2;1 基因表達(dá)分析

根據(jù)AgPIP2;1 的序列,設(shè)計(jì)一對PIP2-BD-F(GC AGTCATAGCGGAGTTCATAGCA)和PIP2-BD-R(GAA TGCCAACGCCACCACACT),采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。芹菜內(nèi)參基因AgACTIN的引物為AgACTIN-BD-F(AGAAGTCCTGTTC CAGCCGTCTT)和AgACTIN-BD-R(CGAACCACCACTG AGCACTATGTT)[19]。反應(yīng)體系:ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase Free ddH2O 7.2 μL。在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng),具體程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火20 s,72℃延伸15 s,40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法[20]分析目的基因的相對表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Office Excel 2013 和SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析,使用Duncan 法進(jìn)行多重比較和差異顯著性分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜AgPIP2;1 基因的克隆與序列分析

以芹菜品種六合黃心芹的cDNA 為模板,經(jīng)過RT-PCR 獲得了1 條大約1 000 bp 的片段(圖1)?；厥諟y序后得到一條1 028 bp 的片段,其含有1 個(gè)861 bp 的開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼286個(gè)氨基酸(圖2),預(yù)測其蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為30.68 kD,等電點(diǎn)為8.27。

圖1 芹菜AgPIP2;1 基因的RT-PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.1 RT-PCR amplification pattern of AgPIP2;1 gene from celery

2.2 芹菜AgPIP2;1 基因及其編碼蛋白的序列分析

NCBI BLAST 比對發(fā)現(xiàn),AgPIP2;1 基因編碼的蛋白屬于PIP2 類家族蛋白。AgPIP2;1 蛋白GRAVY 值為0.450,是疏水性蛋白,不穩(wěn)定系數(shù)(instability indexⅡ)為28.84,為穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測AgPIP2;1基因定位于質(zhì)膜上。SOPMA 軟件預(yù)測AgPIP2;1 的二級結(jié)構(gòu)含有32.52%α-螺旋、18.18%延伸鏈、3.5%β-轉(zhuǎn)角和45.80%隨機(jī)卷曲。TMHMM 軟件分析顯示,AgPIP2;1 具有6 個(gè)跨膜區(qū)(分別位于氨基酸序列第40～62、77～99、122～144、169～188、201～223、249～271位),由膜兩側(cè)的5 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接,其中第1、第3 和第5 環(huán)在細(xì)胞膜外,第2 和第4 環(huán)及N、C 末端都位于細(xì)胞膜內(nèi)(圖3)。以菠菜SoPIP2;1(PDB ID:4jc6.2.D)為模板,采用Swiss-Model 在線軟件對該蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)AgPIP2;1 的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成,且以四聚體的形式存在(圖4)。

2.3 芹菜AgPIP2;1 的氨基酸序列同源性分析

將芹菜AgPIP2;1 的氨基酸序列分別與胡蘿卜(Daucus carota)DcPIP2;1 和DcPIP1;3、綠豆(Vigna radiate)VrPIP2;1、大豆(Glycine max)GmPIP2;1、蘋果(Malus domestica)MdPIP2;2、萵苣(Lactuca sativa)LsPIP2;5、野草莓(Fragaria vesca)FvPIP2;1、玉米(Zea mays)ZmPIP1;1、高粱(Sorghum bicolor)SbPIP1;2、擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtPIP1;4、蘿卜(Raphanus sativus)RsPIP1;1、南瓜(Cucurbita moschata)CmPIP1;3及甜瓜(Cucumis melo)CmPIP1;2 的氨基酸序列進(jìn)行BLAST 同源性比對,發(fā)現(xiàn)芹菜的AgPIP2;1 氨基酸序列與其他物種的PIP2 氨基酸序列具有較高的同源性,其中與胡蘿卜DcPIP2;1 的氨基酸序列同源性達(dá)到97.90%,但與PIP1 類氨基酸序列同源性相對偏低;相對于PIP1 類蛋白,PIP2 類蛋白N 端更短,而C 端更長。此外,AgPIP2;1 具有兩個(gè)高度保守的NPA 基序、MIP 家族特有的SGGHINPAVTFG 序列以及植物PIPs的保守序列 GGGANXXXXGY 和 TGI/TNPARSL/FGAAI/Ⅵ/VF/YN(圖5)。

圖2 芹菜AgPIP2;1 基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid and predicted amino acid sequences of AgPIP2;1 gene from celery

圖3 AgPIP2;1 的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 The transmembrane region prediction of AgPIP2;1

圖4 AgPIP2;1 的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 The predicted three-dimensional structure of AgPIP2;1

2.4 芹菜AgPIP2;1 的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用Mega 5 軟件對芹菜AgPIP2;1 基因編碼的氨基酸序列與部分物種的PIP 氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。由圖6 可知,13 個(gè)物種共14 個(gè)PIP 蛋白分為兩類,其中PIP1 占據(jù)一個(gè)分支,PIP2 占據(jù)另一個(gè)分支。AgPIP2;1 屬于PIP2 亞類,與同屬PIP2 亞類的其余物種的氨基酸序列同源性明顯高于PIP1 亞類,AgPIP2;1 與大豆GmPIP2;1、胡蘿卜DcPIP2;1 和綠豆VrPIP2;1 的親緣關(guān)系較為接近。

2.5 芹菜AgPIP2;1 基因在不同組織的表達(dá)和對非生物脅迫的響應(yīng)

由圖7 可知,AgPIP2;1 基因在芹菜根、葉柄和葉片中均有表達(dá),但相對表達(dá)量差異較大。其中,在芹菜葉片中的表達(dá)水平最高,葉柄次之,在根中的表達(dá)水平最低,呈現(xiàn)比較明顯的組織特異性。

芹菜AgPIP2;1 基因表達(dá)水平在高溫(38℃)、低溫(4℃)、模擬干旱(20% PEG 6000)和鹽(200 mmol·L-1NaCl)非生物脅迫處理后發(fā)生顯著變化(圖8)。高溫(38℃)處理下,隨著處理時(shí)間的延長,AgPIP2;1 基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且在處理后2～8 h 時(shí)維持較高的表達(dá)水平;低溫(4℃)和模擬干旱(20% PEG 6000)條件下,芹菜AgPIP2;1基因表達(dá)水平均在處理后24 h 升至最高;鹽脅迫處理(200 mmol·L-1NaCl)下,AgPIP2;1 基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降再上升的趨勢,在處理后1 h 時(shí)達(dá)到峰值,之后下降,在處理后8 h 時(shí)AgPIP2;1 基因的相對表達(dá)量達(dá)到最低。

圖5 芹菜AgPIP2;1 與其他物種PIP 氨基酸序列的多重比對Fig.5 Multiple alignment of amino acid sequences of AgPIP2;1 from celery and PIPs from other species

3 討論

水分子可通過自由擴(kuò)散的形式進(jìn)出細(xì)胞,但速率緩慢,不能滿足特定情況下細(xì)胞代謝的需求。水孔蛋白是細(xì)胞膜上調(diào)控水分等小分子物質(zhì)跨越細(xì)胞膜快速運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)蛋白,普遍存在于動物和植物等生物中[21]。自第1 個(gè)水孔蛋白在動物中被發(fā)現(xiàn)以來,越來越多的動植物和微生物水孔蛋白基因被分離和鑒定[22]。本研究從芹菜六合黃心芹中克隆得到了1 個(gè)水孔蛋白基因AgPIP2;1,具有水孔蛋白典型的6 個(gè)跨膜區(qū)、2 個(gè)NPA 基序以及高等植物PIPs 特有的GGGANXXXXGY 和TGINPARSL/FGAAI/VIYN 高 度保守序列,亞細(xì)胞定位預(yù)測該蛋白定位于質(zhì)膜上,這些特征是水孔蛋白分類的重要標(biāo)準(zhǔn),也是執(zhí)行水孔蛋白功能的關(guān)鍵序列單元[23]。此外,AgPIP2;1 基因與PIP2 類蛋白同源性較高,與胡蘿卜DcPIP2;1 的同源性達(dá)到97.90%,但與PIP1 類同源性相對偏低,說明了水孔蛋白家族內(nèi)部不同類別的高度保守性。

圖6 芹菜AgPIP2;1 與部分物種PIP 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of amino acid sequences of AgPIP2;1 from celery and PIPs from several plant species

圖7 AgPIP2;1 基因在芹菜不同組織中的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of AgPIP2;1 gene in different tissues of celery

水孔蛋白參與植物花的發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、葉片蒸騰等過程[1,24-25],因此,水孔蛋白不同成員在不同組織的差異表達(dá)可能與其具體擔(dān)負(fù)的生理功能有關(guān)。本研究克隆的AgPIP2;1 基因在葉片中表達(dá)最高,表明該基因可能主要在葉片中發(fā)揮功能。大量研究結(jié)果表明,PIPs 通過調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸參與植物抵御非生物脅迫的過程[3]。Heinen 等[26]指出低溫馴化過程中PIP轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)有助于防止凍干引起的細(xì)胞脫水,從而提高細(xì)胞的抗凍性。煙草植株中過表達(dá)芥菜BjPIP1 時(shí),能降低蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度,保持葉片合理的水分狀態(tài),增強(qiáng)植株對干旱和鎘的抗性[27]。在番茄中,PIP2 類基因可通過提高細(xì)胞膜的導(dǎo)水率來增強(qiáng)植株在正常和干旱脅迫下的生存能力[28]。將野生大豆的GsPIP2;1 基因異源表達(dá)進(jìn)擬南芥中,發(fā)現(xiàn)植株對于鹽脅迫以及水分脅迫的敏感性發(fā)生變化[29]。此外,PIP2 能與其他逆境響應(yīng)因子互作調(diào)節(jié)水分傳輸,共同參與植株應(yīng)對鹽脅迫的過程[30]。本研究克隆的AgPIP2;1 基因能響應(yīng)高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo),說明該基因參與了植株抵御非生物脅迫的過程,其可能通過調(diào)節(jié)根部和葉片的水分吸收、運(yùn)輸和消耗來提高植株的抗逆性。但AgPIP2;1 基因如何響應(yīng)信號因子啟動抗逆反應(yīng),以及在不同非生物逆境中的應(yīng)對和調(diào)節(jié)方式是否有變化,尚需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究克隆的芹菜AgPIP2;1 基因?qū)儆赑IP2 類家族成員,在芹菜葉片中的表達(dá)水平最高,葉柄次之,在根中的表達(dá)水平最低,呈現(xiàn)比較明顯的組織特異性,且能夠響應(yīng)高溫、低溫、干旱和鹽等非生物脅迫,說明該基因可能參與了植株抵御非生物脅迫的過程,但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為接下來開展該基因在芹菜抵御非生物脅迫中的作用及其調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。鑒于該基因可響應(yīng)非生物脅迫的誘導(dǎo),將來在明確其功能及其調(diào)控機(jī)制的情況下可有望利用該基因進(jìn)行抗逆育種,為提高芹菜等作物對干旱等非生物脅迫的適應(yīng)能力提供思路和方向。

圖8 芹菜AgPIP2;1 基因?qū)Σ煌巧锩{迫的響應(yīng)Fig.8 Responses of AgPIP2;1 gene from celery to different abiotic stresses