劉 宇 閆彩霞 李春娟 徐洪明 孔 青 孫全喜王 娟 單世華

(1山東省花生研究所,山東 青島 266100;2中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266000;3東阿縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,山東 聊城 252200)

花生是一年生草本植物,作為我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一,是優(yōu)質(zhì)植物油和植物蛋白的重要來(lái)源[1-2]。其中,花生栽培種(Arachis hypogaeaL.)為異源四倍體(2n=4x=40,AABB)[3],與野生種(Arachisspp.)相比,其低水平的遺傳變異與有限的種質(zhì)資源[4-5]限制了栽培種花生育種的研究與發(fā)展。雖然傳統(tǒng)育種獲得較大突破,但仍存在育種效率低、周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。為了加快育種進(jìn)程、縮短育種時(shí)間,以分子標(biāo)記輔助育種為核心的育種體系,成為分子育種的重要研究?jī)?nèi)容。近年來(lái),測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使得新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)向低成本、高通量的方向發(fā)展[6],其中以測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。目前所開發(fā)的分子標(biāo)記有上萬(wàn)個(gè),但在花生中僅有14.5%的分子標(biāo)記顯示具有多態(tài)性,可用于構(gòu)建遺傳圖譜的分子標(biāo)記只有6.4%[7]。開發(fā)新的花生分子標(biāo)記已成為當(dāng)前研究的重要一環(huán)。

插入/缺失多態(tài)性(insertion-deletion,InDel)作為結(jié)構(gòu)變異(structure variants,SVs)的重要組成部分廣泛的存在于基因組中,其分布密度僅次于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[8],且在一些農(nóng)作物中InDel 標(biāo)記的多態(tài)性高于簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)標(biāo)記[9]。與SNP 標(biāo)記相比,InDel 標(biāo)記設(shè)計(jì)與檢測(cè)更簡(jiǎn)單[10]。同時(shí),InDel標(biāo)記作為一種新型的共顯性分子標(biāo)記,兼具各類遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn),具有開發(fā)成本低、準(zhǔn)確性高、變異穩(wěn)定、易于分型等優(yōu)點(diǎn)[11]。此外,同樣長(zhǎng)度的2 個(gè)InDel 變異不可能出現(xiàn)在同一個(gè)基因組位點(diǎn)上[12]。

目前基于全基因組水平開發(fā)的InDel 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于水稻[13]、沙梨[14]、油菜[15]、黃瓜[16]、葡萄[17]、棉花[18]等植物研究領(lǐng)域。季高翔等[19]基于棉花重測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)了新標(biāo)記,將矮化基因AS98 重新定位于D12 染色體InDel 50 和InDel 83 標(biāo)記之間,物理間距45 kb。Chung 等[20]基于345 份玉米基因組重測(cè)序獲得1 973 746 個(gè)獨(dú)立的InDel 位點(diǎn),這些InDel 位點(diǎn)多位于基因編碼區(qū),利用100 對(duì)引物對(duì)4 份玉米材料進(jìn)行鑒定,獲得了89 個(gè)多態(tài)性引物。但在花生全基因組水平上開發(fā)和應(yīng)用的 InDel 標(biāo)記相對(duì)較少,Vishwakarma 等[21]基于花生全基因水平上開發(fā)出515 223 個(gè)InDels,并用長(zhǎng)度大于50 bp 的InDel 位點(diǎn)設(shè)計(jì)5 698 對(duì)引物,利用其中214 個(gè)InDel 引物篩選出86 對(duì)多態(tài)性引物。本研究基于王娟等[22]簡(jiǎn)化的花生基因組測(cè)序(reduced-representation genome sequencing,RRGS)結(jié)果,增加測(cè)試深度與廣度,篩選InDel 位點(diǎn),選取遺傳背景較大的覆蓋4 個(gè)植物學(xué)類型的花生種質(zhì)進(jìn)行InDel 標(biāo)記的有效性檢驗(yàn),并評(píng)估其在花生研究中的應(yīng)用潛力,以期豐富可用于栽培種花生的分子標(biāo)記,為InDel 標(biāo)記在栽培種花生優(yōu)異基因挖掘、基因精細(xì)定位、遺傳多樣性分析等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取21 份遺傳背景差異較大的4 個(gè)植物學(xué)類型的花生種質(zhì)作為檢測(cè)引物有效性材料,其中普通型6份、龍生型5 份、珍珠豆型7 份、多粒型3 份(表1)。每份種質(zhì)選取2 粒完整飽滿種子,于培養(yǎng)皿中避光浸種3～4 d,待芽長(zhǎng)至2～4 cm 后置于光照培養(yǎng)箱(溫度25℃,光照強(qiáng)度12 000 Lux)培養(yǎng)10 ～13 d,取幼嫩新葉。

表1 21 份花生種質(zhì)信息表Table 1 Information of 21 peanut germplasms

1.2 InDel 位點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì)

基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序結(jié)果,利用Mircosoft Office Excel 2010 篩選出插入/缺失堿基數(shù)為3 ～12 bp 的InDel 位點(diǎn)?；诨ㄉ耘喾N基因組序列,將篩選出的位點(diǎn)定位在基因組上,于InDel 位點(diǎn)兩翼各200 bp 長(zhǎng)度內(nèi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)使用Primer 6.0,上游設(shè)計(jì)范圍為1～200 bp,下游設(shè)計(jì)范圍為213 ～401 bp,產(chǎn)物大小在150～350 bp 之間,退火溫度50～60℃。引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 DNA 提取

采用植物基因組DP305-2 DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取材料花生的DNA,P100/P100+ Nanodrop-超微量分光光度計(jì)(Pultton,美國(guó))檢測(cè)基因組DNA 質(zhì)量與濃度,濃度稀釋至20 ng·μL-1。

1.4 PCR 擴(kuò)增和電泳分析

25 μL PCR 反應(yīng)體系:2 × EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL、DNA 模板0.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性50 s,60℃退火1 min,72℃延伸50 s,34 個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min,4℃條件保存。

6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)電泳,電壓100 Ⅴ,電泳2 ～3 h。銀染顯色(參照張軍等[23]的銀染方法),拍照保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)引物對(duì)21 份花生種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行記錄,有帶記為1,無(wú)帶記為0,缺失記為-,并使用A、B、C、D等大寫字母記錄基因型。利用POPGENE 軟件計(jì)算Shannon 指數(shù)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)。根據(jù)公式計(jì)算多態(tài)性信息量(polymorphism information content,PIC),即PIC=1-∑(xi)2,其中xi表示InDel位點(diǎn)第i個(gè)等位基因的相對(duì)頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel 標(biāo)記的鑒定

通過(guò)篩選獲得插入/缺失為3 ～12 bp 的InDel 位點(diǎn)共39 個(gè),根據(jù)其位置信息設(shè)計(jì)39 對(duì)InDel 標(biāo)記引物。由表2 可知,13 號(hào)染色體有6 個(gè)位點(diǎn),12 號(hào)染色體有4 個(gè)位點(diǎn),其余染色體位點(diǎn)較少。此外,有11 個(gè)位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域,18 個(gè)位點(diǎn)位于內(nèi)含子區(qū)域,5′端非翻譯區(qū)7 個(gè)位點(diǎn),3′端非翻譯區(qū)3 個(gè)位點(diǎn)。由此可推測(cè),栽培種花生基因組中的InDel 變異多位于非編碼序列。

表2 本研究篩選的39 個(gè)InDel 標(biāo)記信息Table 2 The information of the 39 InDel markers screened in this study

表2(續(xù))

2.2 InDel 標(biāo)記有效性檢驗(yàn)

以21 份花生種質(zhì)基因組DNA 為模板,采用PCR方法檢驗(yàn)39 對(duì)引物的有效性。39 對(duì)引物均能擴(kuò)增出清晰、均一的條帶,條帶大小與預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小基本相同。經(jīng)統(tǒng)計(jì)獲得多態(tài)性引物14 對(duì),占總設(shè)計(jì)引物數(shù)的35.9%。其中,引物InDel-28 擴(kuò)增結(jié)果變異最為豐富,獲得5 種不同類型的條帶(圖1-A);引物InDel-19擴(kuò)增獲得3 種類型條帶,但僅有2 份種質(zhì)出現(xiàn)變異(圖1-B);InDel-23 引物擴(kuò)增獲得2 種類型條帶,變異較為豐富(圖1-C)。

圖1 3 個(gè)InDel 標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The polymorphism detection results of 3 InDel primers

2.3 InDel 標(biāo)記在鑒定種質(zhì)資源和特異性中的應(yīng)用及其功能評(píng)價(jià)

利用軟件POPGENE 1.32 對(duì)14 對(duì)多態(tài)性引物在21 份花生種質(zhì)中的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。由表3 可知,14 對(duì)引物共檢測(cè)出36 個(gè)等位基因,等位基因數(shù)為2 ～5 個(gè),平均每個(gè)標(biāo)記2.571 4 個(gè)。有效等位基因數(shù)介于1.099 8～3.073 2 之間,平均值為1.630 2。其中InDel-28 位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多,為5 個(gè);8 個(gè)InDels 位點(diǎn)只檢測(cè)到2 個(gè)等位基因;5 個(gè)InDels 位點(diǎn)檢測(cè)到3 個(gè)等位基因。Shannon 指數(shù)分布在0.191 4 ～1.295 1 之間,平均值為0.579 4,其中,InDel-36 標(biāo)記Shannon 指數(shù)最低。PIC 介于0.090 7 ～0.674 6 之間,平均值為0.349 6,其變化趨勢(shì)與Shannon 指數(shù)一致,其中InDel-28 標(biāo)記PIC 最高,而InDel-36 標(biāo)記的PIC最低。

14 個(gè)InDel 標(biāo)記中有3 個(gè)標(biāo)記位于基因編碼區(qū)域,其中重要的2 個(gè)標(biāo)記:InDel-04 標(biāo)記與CCCH 型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子有關(guān),InDel-11 標(biāo)記與bHLH 130 轉(zhuǎn)錄因子有關(guān),這2 個(gè)基因均會(huì)影響到花生的抗逆性,標(biāo)記可用于育種選擇。11 個(gè)InDel 標(biāo)記位于基因的非編碼區(qū)域,其中InDel-23 和InDel-24 標(biāo)記均與花生的抗葉銹病有關(guān);InDel-28、InDel-29、InDel-36 標(biāo)記分別影響細(xì)胞色素P450、驅(qū)動(dòng)蛋白NACK1 以及半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的功能。

綜上,開發(fā)的14 個(gè)InDel 標(biāo)記可用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、農(nóng)藝性狀的QTL 定位和育種性狀選擇。

表3 基于14 個(gè)InDel 標(biāo)記的多態(tài)性信息Table 3 The polymorphism information based on 14 InDel markers

3 討論

DNA 分子標(biāo)記多態(tài)性水平的高低通常作為評(píng)估其應(yīng)用潛力的標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究成功檢測(cè)到14 對(duì)具備多態(tài)性的InDel 引物,多態(tài)率達(dá)35.9%,PIC 介于0.090 7～0.674 6 之間。王亮等[24]從225 對(duì)AFLP 引物中篩選出42 對(duì)多態(tài)性引物,多態(tài)率為18.6%;劉陽(yáng)杰等[25]用12 對(duì)SSR 引物與48 對(duì)InDel 引物擴(kuò)增77份美國(guó)花生種質(zhì),分別獲得4 對(duì)多態(tài)性SSR 引物(多態(tài)率33.3%)和15 對(duì)多態(tài)性InDel 引物(多態(tài)率31.3%);Vishwakarma 等[21]利用4 份不同植物學(xué)類型的花生種質(zhì)對(duì)214 個(gè)InDel 標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選,獲得86 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記,多態(tài)率達(dá)40.2%;Liu 等[26]從功能基因的保守序列中開發(fā)出48 個(gè)InDel 標(biāo)記,對(duì)6 個(gè)不同植物學(xué)類型的118 份栽培種花生篩選,獲得16 個(gè)多態(tài)性InDel 標(biāo)記,多態(tài)率為33.3%,且PIC 為0.017～0.660;Meng 等[27]利用4 個(gè)植物學(xué)類型的54 份花生種質(zhì)對(duì)48 個(gè)InDel 引物進(jìn)行篩選,其中24 對(duì)引物具有多態(tài)性,多態(tài)率高達(dá)50.0%,PIC 為0.036 4～0.903 0。上述研究的分子標(biāo)記的多態(tài)率分布于18.6%～50.0%之間。通常評(píng)估分子標(biāo)記的多態(tài)性水平的精確性與用于標(biāo)記篩選的種質(zhì)數(shù)量和種質(zhì)之間的系譜差異有較大關(guān)系。與上述報(bào)道相比,本研究篩選獲得的InDel 標(biāo)記處于中等多態(tài)性水平,可能是因?yàn)楸狙芯績(jī)H選用了篩選的21 份花生種質(zhì)。但本研究所選用種質(zhì)材料覆蓋了4 種植物學(xué)類型和代表性種植區(qū)域,這種遺傳背景差異大的花生種質(zhì)具有較強(qiáng)的代表性,由此篩選的InDel 標(biāo)記能夠?yàn)榛ㄉN質(zhì)遺傳多樣性分析提供重要參考。

目前,雖然已開發(fā)出大量的分子標(biāo)記,但只有較少的重要性狀如抗線蟲病[28]和高油酸[29]等被應(yīng)用到花生分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)程中,還有較多如抗銹病、晚葉斑病以及青枯病[30-31]等重要性狀尚處于開發(fā)狀態(tài)。本研究篩選獲得的InDel 標(biāo)記中有2 個(gè)重要標(biāo)記位于基因的編碼區(qū)域:InDel-04 標(biāo)記與CCCH 型鋅指蛋白的功能有關(guān),該類型的鋅指蛋白不僅在植物發(fā)育與脅迫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用,而且對(duì)次生壁的形成以及花藥的發(fā)育產(chǎn)生影響[32];InDel-11 標(biāo)記與bHLH130 轉(zhuǎn)錄因子有關(guān),該類型轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及非生物脅迫響應(yīng)方面至關(guān)重要。Guang等[33]研究發(fā)現(xiàn)棉花中bHLH130 基因表達(dá)受干旱、低溫的誘導(dǎo),可能作為調(diào)控基因參與逆境應(yīng)答過(guò)程。同樣,在花生的非編碼區(qū)中也獲得了多個(gè)重要標(biāo)記,其中InDel-23 標(biāo)記、InDel-24 標(biāo)記分別與抗葉銹類Lr10 激酶、Lr10 抗病基因位點(diǎn)蛋白激酶受體有關(guān),對(duì)植物的抗葉銹能力起到關(guān)鍵作用;標(biāo)記InDeI-28 會(huì)影響花生中細(xì)胞色素P450 的合成,并且細(xì)胞色素P450 與植物的次生代謝的合成與解毒有著密切關(guān)系。有報(bào)道指出,在除草劑苯達(dá)松及甲磺隆誘導(dǎo)下,與細(xì)胞色素P450 合成相關(guān)的CYP81A6 基因會(huì)過(guò)量表達(dá)[34]。綜上,本研究篩選獲得的14 個(gè)InDel 標(biāo)記,尤其是位于基因編碼區(qū)的InDel-04、InDel-11 標(biāo)記,可為后續(xù)的功能標(biāo)記開發(fā)提供重要參考。InDel 標(biāo)記作為一種較新的遺傳標(biāo)記,其相關(guān)的生物學(xué)功能和意義需要逐漸探索與挖掘,并通過(guò)進(jìn)一步的驗(yàn)證分析,使其能夠盡早應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)程中。

4 結(jié)論

本研究成功篩選得到14 個(gè)多態(tài)性InDel 標(biāo)記,這些標(biāo)記具有較高的遺傳多樣性。其中3 個(gè)多態(tài)性標(biāo)記位于基因編碼區(qū),尤其是InDel-04、InDel-11 標(biāo)記均與花生抗逆性相關(guān),且在基因的非編碼區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了多個(gè)標(biāo)記與花生重要性狀相關(guān)。本研究不僅豐富了用于栽培種花生的InDel 標(biāo)記,而且這些InDel 標(biāo)記可為后續(xù)功能驗(yàn)證以及進(jìn)一步開展栽培種花生種質(zhì)資源鑒定提供有效工具。但這些標(biāo)記尚需通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)(real-time fluorescence quantitative PCR)和基因編輯等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的功能鑒定和驗(yàn)證。