楊雙娟 王志勇 趙艷艷 魏小春 原玉香 張曉偉

(河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所,河南 鄭州 450002)

大白菜(Brassica rapaL.ssp.pekinensis)是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一,在我國蔬菜作物中占有重要地位[1-2]。在生產(chǎn)上,如果播種時期不適宜或者外界環(huán)境的刺激,都會造成大白菜先期抽薹,從而影響葉球的產(chǎn)量和品質(zhì),造成嚴重的經(jīng)濟損失[3-4]。因此,開發(fā)與抽薹相關(guān)的特異分子標記,對于培育耐抽薹的大白菜新品種具有重要意義。

FLOWERING LOCUS C(FLC)編碼MADS-box 類轉(zhuǎn)錄因子,是擬南芥的開花抑制因子,其通過抑制FT(Flowering Locus T)和SOC1 基因的表達,阻止頂端分生組織從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換,從而抑制擬南芥的開花[5-7]。目前白菜類作物中已克隆了4 個FLC同源基因(BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3 和BrFLC5)[8],在擬南芥中過表達BrFLC1、BrFLC2 和BrFLC3 能夠明顯延遲抽薹開花[9]。同時,正向遺傳學研究表明BrFLC1是控制抽薹開花的1 個主效QTL 位點[10-11]。Yuan等[3]研究發(fā)現(xiàn)BrFLC1 基因第6 個內(nèi)含子的第1 個堿基(Pi6+1)G-A 的SNP 變異和大白菜抽薹開花性狀顯著相關(guān),G-A 突變改變了pre-mRNA 的剪切方式,當Pi6+1 處堿基由G 突變成A 后,可變剪切產(chǎn)生不正常的轉(zhuǎn)錄本,導致終止密碼子提前出現(xiàn)或缺失一段外顯子,進而導致BrFLC1 蛋白功能缺失,正常的延遲開花功能喪失。原玉香等[12]針對此單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位點開發(fā)了酶切擴增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)標記G-MvaI。但CAPS 標記需要結(jié)合PCR 擴增、限制性內(nèi)切酶酶切和凝膠電泳才能實現(xiàn)基因分型,且其步驟較多,耗時較長,不能實現(xiàn)高通量、大樣本量的檢測。競爭性等位基因特異性 PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP),基于引物末端堿基的特異性匹配對SNP 進行精準的雙等位基因判斷,具有準確性高、低成本、高通量等優(yōu)點,是目前國際上主流的SNP 分型方法[13-15]。目前,KASP 基因分型技術(shù)已應(yīng)用于動植物的遺傳圖譜構(gòu)建[16]、基因定位[17-18]、關(guān)聯(lián)分析[19-20]、種質(zhì)資源多樣性分析[21-22]、分子標記輔助育種[23]、種子純度鑒定[24]等方面,而關(guān)于大白菜KASP 標記的開發(fā)及應(yīng)用的研究尚鮮有報道。

本研究針對BrFLC1 基因Pi6+1 處G-A 的SNP 變異開發(fā)KASP 分子標記,并驗證該標記的實用性和準確性,以期為大白菜晚抽薹育種的分子標記輔助選擇提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大白菜材料共57 份,均來自河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所。其中Y177-12 和Y195-93 用于前期開發(fā)KASP 標記,Y177-12 來源于日本商品種健春,屬于晚抽薹類型;Y195-93 來源于商品種熱抗白45,屬于早抽薹類型。其余55 份用于KASP 標記通用性的驗證。

1.2 基因組DNA 提取

將57 份大白菜材料的種子放在培養(yǎng)皿中加水催芽,待下胚軸長至1.5 ～2 cm 時,取子葉于2.0 mL Eppendorf 離心管中,采用CTAB 法[25]提取大白菜基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One(Thermo Scientific 公司,美國)檢測DNA 的質(zhì)量和濃度。

1.3 BrFLC1 的KASP-SNP 分子標記開發(fā)

從NCBI 上下載BrFLC1 基因的 DNA 序列(GeneBank 登陸號:AY115678),該序列全長1 651 bp,第6 個內(nèi)含子的第1 堿基(Pi6+1)G-A 的SNP 變異和大白菜抽薹性狀顯著相關(guān)[12],該SNP 位點位于BrFLC1 基因序列的第1 101 bp 處。針對此SNP 位點設(shè)計KASP 標記BrFLC1-KASP1,包括3 條引物:BrFLC1-KASP1-A1:5′-FAM-CCATGTTTTGGCTAGCCA GG-3′;BrFLC1-KASP1-A2:5′-HEX-CCATGTTTTGGCT AGCCAGA-3′;BrFLC1-KASP1-C:5′-ATCGGATCGAAA CTTAAACCGT-3′。BrFLC1-KASP1-A1 和BrFLC1-KASP1-A2 為2 條等位基因特異性正向引物,3′末端堿基為Pi6+1 處SNP 位點變異堿基(G 或A),5′端分別加上FAM 和HEX 熒光序列標簽序列。BrFLC1-KASP1-C 為共同的反向引物。引物均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 KASP 基因分型

KASP-PCR 反應(yīng)在384 孔PCR 儀(Eppendorf Mastercycler pro,德國)上進行,反應(yīng)體系4 μL:1 μL DNA(60 ng·μL-1),2 μL KASP Master mix(2×),0.07 μL 引物混合物(由濃度為100 μmol·L-1的BrFLC1-KASP1-A1、BrFLC1-KASP1-A2、BrFLC1-KASP1-C 與ddH2O 按12∶12∶30∶46 的體積比混合得到),ddH2O 補足至4 μL。

KASP-PCR 擴增程序:第一階段94℃變性15 min;第二階段94℃變性20 s,61℃退火60 s,共10 個循環(huán)(從第2 個循環(huán)開始,每個循環(huán)降低0.6℃,);第三個階段94℃變性20 s,55℃退火60 s,共26 個循環(huán);第四階段37℃降溫保持1 min。

KASP-PCR 擴增產(chǎn)物用LC480II 熒光定量PCR 儀(羅氏,瑞士)進行終點法熒光信號讀取。利用LC480 software v1.5.1 分析SNP 分型結(jié)果:聚合在X 軸附近的顯示藍色的基因型為連接FAM 熒光標簽序列的等位基因型,聚合在Y 軸附近的顯示綠色的基因型為連接HEX 熒光標簽序列的等位基因型,中間顯示紅色的基因型為兩種等位基因的雜合型,左下角顯示黑色的樣本為空白對照。

1.5 CAPS 法和直接測序法對BrFLC1-KASP1 鑒定結(jié)果的驗證

參照原玉香等[12]的方法,利用CAPS 標記G-MvaI對57 份大白菜材料進行基因型鑒定:使用引物FLC1F4 和FLC1R1 進行PCR 擴增,之后用限制性內(nèi)切酶MvaI進行酶切。酶切體系15 μL:5 μL PCR 擴增產(chǎn)物,1 μL 10×Buffer R,0.5 μL 限制性內(nèi)切酶MvaI(10 U·μL-1),8.5 μL ddH2O。37℃保溫2.0 h 完全酶切,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；蛐蜑镚 時,MvaI能夠?qū)CR 產(chǎn)物剪切成448 bp 和491 bp 的兩個片段;基因型為A 時,PCR 產(chǎn)物不能被MvaI酶切,片段長度為940 bp。

直接測序法:使用引物FLC1F4 和FLC1R1 進行PCR 擴增,之后將PCR 擴增產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司使用引物FLC1R1 進行單向測序,獲得的測序峰圖文件用SeqMan(Version 7.1)軟件進行多序列比對,確定各樣品的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrFLC1-KASP1 分子標記的開發(fā)

針對BrFLC1 基因Pi6+1 處G-A 的SNP 變異設(shè)計KASP 標記BrFLC1-KASP1。原玉香等[12]通過測序分析得知Y177-12 和Y195-93 在Pi6+1 處的堿基分別為G 和A。利用標記BrFLC1-KASP1 對Y177-12 和Y195-93 進行基因型鑒定,結(jié)果顯示,Y177-12 的信號點為藍色,5′末端連接FAM 熒光標簽序列的引物競爭性擴增,聚合在X 軸附近,表明其基因型為G∶G;Y195-93 的信號點為綠色,5′末端連接HEX 熒光標簽序列的引物競爭性擴增,聚合在Y 軸附近,表明其基因型為A∶A(圖1-A)。綜上,BrFLC1-KASP1 對Y177-12 和Y195-93 基因型鑒定結(jié)果與原玉香等[12]測序結(jié)果一致,BrFLC1-KASP1 標記開發(fā)成功。

將Y177-12 和Y195-93 的基因組DNA 分別稀釋成10、20、60、80、100、150、200 和400 ng·μL-1,利用BrFLC1-KASP1 標記進行KASP 基因分型。結(jié)果顯示,10～400 ng DNA 模板量均能產(chǎn)生較好的KASP 基因分型(圖1-B),表明BrFLC1-KASP1 標記對模板DNA 的濃度敏感度較小,模板量許可范圍較大。

圖1 BrFLC1-KAPS1 分子標記的開發(fā)Fig.1 The development of marker BrFLC1-KAPS1

2.2 BrFLC1-KAPS1 分子標記的通用性

為了驗證BrFLC1-KASP1 標記在其他大白菜材料中的適用性和通用性,利用該標記對57 份大白菜材料進行基因分型。結(jié)果顯示,標記BrFLC1-KASP可將57份材料劃分為3 組,其中21 份材料的信號點為藍色,基因型為G∶G;34 份材料的信號點為綠色,基因型為A∶A;樣品J3 為Y177-12 和Y195-93 雜交而得的F1,樣品P3 為SY2004 和YR16-11 的雜交種,這2 份材料的信號點為紅色,為雜合基因型G∶A(圖2-A、B 和表1),表明該標記不僅能夠有效區(qū)分2 種純合基因型,且能夠鑒別出雜合基因型,具有共顯性特點,在大白菜材料中具備通用性和實用性。此外,KASP 基因型讀取時,可以按照圖2-A 所示每個樣品所顯示的顏色來鑒定基因型,藍色基因型為G∶G,綠色為A∶A,紅色為雜合G∶A,基因型讀取方便高效。

2.3 BrFLC1-KAPS1 分子標記的準確性

為驗證BrFLC1-KASP1 標記對57 份大白菜材料基因分型的準確性,利用CAPS 標記G-MvaI和直接測序法對57 份材料進行基因分型。CPAS 標記G-MvaI基因分型結(jié)果和KASP 標記BrFLC1-KASP1 的分型結(jié)果完全一致(表1 和圖3)。其中21 份材料的電泳條帶大小在500 bp 左右,為448 bp 和491 bp 2 個片段的混合物[3],基因型為G∶G;34 份材料的電泳條帶為940 bp,基因型為A∶A;樣品J3 和P3 同時具有上述2種條帶,是雜合類型,基因型為G∶A。直接測序法是檢測SNP 的金標準[26-27]。本試驗對57 份大白菜材料進行直接測序,分析發(fā)現(xiàn)57 份材料的基因型與KASP 標記BrFLC1-KASP1 和CPAS 標記G-MvaI基因分型結(jié)果完全一致(表1)。由圖4 可知,樣品J3 和P3 在Pi6+1處測序峰圖為A 和G 兩種堿基,即基因型為雜合G∶A,與BrFLC1-KASP1 以及G-MvaI的檢測結(jié)果一致。

3 討論

KASP 基因分型技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量,且成本低、準確性高,是目前國際上主流的SNP 分型方法[13,28]。趙勇等[26]比較了直接測序法、CAPS 和KASP 標記技術(shù)3 種方法對大豆Dt1 基因4 個SNP 的分型結(jié)果,發(fā)現(xiàn)KASP 標記技術(shù)最省時,其次是直接測序法,CPAS標記技術(shù)最耗時,且KASP 標記技術(shù)法最經(jīng)濟。Rasheed 等[29]研究認為,從時效性來看,KASP 標記技術(shù)比基于凝膠技術(shù)的分子標記技術(shù)快45 倍。Semagn等[13]研究認為,從經(jīng)濟性和準確性而言,KASP 標記技術(shù)都優(yōu)于DNA 芯片技術(shù)。Ertiro 等[24]比較了KASP和高通量測序基因分型(genotyping by sequencing,GBS)法在玉米種子純度鑒定方面的應(yīng)用,認為KASP標記技術(shù)更經(jīng)濟有效。FLC是蕓薹屬抽薹開花時間調(diào)控的關(guān)鍵基因,前人分別針對抽薹開花相關(guān)基因BrFLC1[12]、BrFLC2[30]、BrFLC5[31]開發(fā)了基于凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)的CAPS、InDel 和dCAPS分子標記,以便用于分子標記輔助育種。

表1 不同基因型分型方法對57 份大白菜材料基因型鑒定結(jié)果Table 1 The genotypes of 57 accessions identified by different genotyping methods in Chinese cabbage

本研究針對BrFLC1 基因Pi6+1 處G-A 的SNP 變異成功開發(fā)了KASP 分子標記BrFLC1-KASP1,這是大白菜開花相關(guān)基因第1 個高通量分子標記。該標記的基因型鑒定結(jié)果與CAPS 標記G-MvaI和直接測序法的鑒定結(jié)果完全一致,證明了BrFLC1-KASP1 標記的準確性和可靠性。而在時效性上,BrFLCl-KASP1 標記通過1 次PCR 即能借助軟件清楚地辨別每個樣品的基因型,效率遠高于基于凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)的分子標記。從經(jīng)濟成本來看,前人開發(fā)的抽薹開花相關(guān)基因的CAPS 和dCAPS 標記的成本絕大部分取決于限制性內(nèi)切酶的成本,限制性內(nèi)切酶的價格高則檢測成本急劇增加,且凝膠電泳還會對環(huán)境造成污染,而本研究的BrFLC1-KASP1 標記整個檢測過程只需要進行1 次PCR,成本低且對環(huán)境友好。此外,對不同DNA 模板量基因分型表明,BrFLC1-KASP1 標記對DNA 模板量許可范圍較大,可以減少對DNA 質(zhì)量的要求以及對DNA 濃度定量的必要性,使KASP 標記操作起來更加方便,擴大KASP 基因分型技術(shù)的應(yīng)用范圍。

圖2 利用標記BrFLC1-KAPS1 對57 份大白菜材料進行KASP 基因分型Fig.2 KASP genotyping of 57 accessions by marker BrFLC1-KAPS1 in Chinese cabbage

圖3 利用CAPS 標記G-MvaI 對57 份大白菜材料進行基因型鑒定Fig.3 The genotypes of 57 accessions identified by CAPS marker G-MvaI in Chinese cabbage

圖4 直接測序法對部分材料的基因型鑒定Fig.4 Genotypes of part accessions identified by sequencing

4 結(jié)論

本研究首次開發(fā)了大白菜抽薹相關(guān)基因BrFLC1的KASP 標記BrFLC1-KASP1,其準確可靠性和通用性都得到了試驗驗證。該標記可以高通量檢測BrFLC1的基因型,能夠高效率、低成本應(yīng)用于大白菜耐抽薹分子標記輔助育種,具有重要的應(yīng)用價值。本研究結(jié)果能為大白菜其他功能基因的KASP 分子標記開發(fā)提供技術(shù)參考,具有重要意義。