陳 健 劉木華 袁海超 黃雙根 趙進(jìn)輝 徐 寧王 婷 胡 圍

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江西南昌 330045)

硫酸新霉素(neomycin sulfate,NEO)和磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SM2)均屬于廣譜抗生素,對(duì)多種致病菌具有抑制或殺滅的效果。它們被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)和治療疾病等領(lǐng)域[1-2]。然而,這些抗生素的大量使用必然會(huì)給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)巨大壓力,特別是未被生物體有效吸收的藥物會(huì)直接進(jìn)入水環(huán)境,不僅危害生態(tài)系統(tǒng)安全,而且會(huì)危害人體健康[3-4]。研究表明,現(xiàn)有的水處理工藝不能徹底去除水體中的痕量抗生素[5-7],我國(guó)作為抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó),水中抗生素污染比其他國(guó)家或地區(qū)更加嚴(yán)重[8-9]。因此,迫切需要一種快速、便捷和可靠的水中抗生素檢測(cè)方法來(lái)規(guī)范水中抗生素污染的現(xiàn)象。

目前,高效液相色譜法[10-12]、免疫分析法[13-14]、毛細(xì)管電泳法[15-16]等均已被用于水中抗生素的檢測(cè)。其中高效液相色譜法抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高,但是運(yùn)行成本高,不易推廣;免疫分析法樣品處理較為困難,部分環(huán)節(jié)成本高;毛細(xì)管電泳法重復(fù)性差。而熒光分析法因其具有線(xiàn)性范圍大、靈敏度高以及可供選擇的參數(shù)多等優(yōu)點(diǎn),在諸多領(lǐng)域得到了應(yīng)用。NEO 屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素,具有氨基糖結(jié)構(gòu),SM2 屬于磺胺類(lèi)抗生素,具有芳伯胺基結(jié)構(gòu),NEO 和SM2 本身不發(fā)熒光,但它們與鄰苯二甲醛在還原劑2-巰基乙醇的作用下會(huì)生成有熒光特性的異吲哚衍生物[17-19],生成路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 鄰苯二甲醛與伯胺類(lèi)化合物衍生反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of derivative reaction of o-phthalaldehyde with primary amines

目前關(guān)于NEO 和SM2 的熒光法檢測(cè)方法大多是對(duì)禽肉、禽蛋、牛奶等的檢測(cè),如徐將等[17]采用熒光法建立了鴨肉中NEO 的測(cè)定方法,檢測(cè)限為1.0 mg·L-1;趙進(jìn)輝等[20]采用導(dǎo)數(shù)同步熒光光譜、小波、分段遺傳算法(subsection genetic algorithm,SGA)和最小二乘支持向量回歸(least square support vector regression,LSSVR)聯(lián)用建立了鴨蛋中NEO 的預(yù)測(cè)模型,模型預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)(R2)為0.967 1;鄧櫻花等[21]采用熒光法建立了蛋清和牛奶中SM2 的檢測(cè)方法,檢出限為2.8 μg·L-1。而有關(guān)水中NEO 或SM2 采用熒光法檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道較少,尤其是水中NEO 和SM2 采用熒光法同時(shí)檢測(cè),鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。同步熒光法具有光散射少、選擇性高和簡(jiǎn)化圖譜等優(yōu)勢(shì)[22]。時(shí)間分辨熒光法適用于對(duì)混合體系中光譜重疊但熒光壽命有差異的組分進(jìn)行檢測(cè)[23-24]。時(shí)間分辨同步熒光法結(jié)合了時(shí)間分辨熒光法與同步熒光法的優(yōu)點(diǎn),能避免水中NEO、SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光光譜重疊[25]。本研究采用時(shí)間分辨同步熒光法同時(shí)對(duì)它們進(jìn)行定性、定量解析,嘗試建立一種水中NEO 和SM2 含量快速檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NEO 標(biāo)準(zhǔn)品(分析標(biāo)準(zhǔn)品),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;SM2 標(biāo)準(zhǔn)品(99.4%),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司;鄰苯二甲醛(99.0%),成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司;2-巰基乙醇(99.0%),成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司;硼酸(≥99.5%),西隴科學(xué)股份有限公司;磷酸(≥85.0%),西隴化工股份有限公司;冰乙酸(≥99.5%),天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì),Varian,Inc.美國(guó);FA1004B 型電子天平(精度為0.1 mg),上海上平儀器有限公司;石英比色皿(1 cm 光程),宜興市晨偉玻璃儀器廠;全自動(dòng)RO 純水機(jī),湖南科爾頓水務(wù)有限公司;JK-50B 型超聲波清洗器,合肥金尼克機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)液及試劑溶液的配制 100.0 mg·L-1NEO 標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取NEO 標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于100.0 mL 容量瓶中,先用少量超純水溶解,待超聲后,冷卻至室溫,再用超純水定容,配制成濃度為100.0 mg·L-1的NEO 標(biāo)準(zhǔn)貯備液;100.0 mg·L-1SM2標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取SM2 標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg 于100.0 mL 容量瓶中,先用少量超純水溶解,待超聲后,冷卻至室溫,再用超純水定容,配制成濃度為100.0 mg·L-1的SM2 標(biāo)準(zhǔn)貯備液。8.0 mg·L-1NEO 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制:準(zhǔn)確量取NEO 標(biāo)準(zhǔn)貯備液8.0 mL 于100.0 mL 容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,配制成濃度為8.0 mg·L-1的NEO 標(biāo)準(zhǔn)工作液;8.0 mg·L-1SM2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制:準(zhǔn)確量取SM2 標(biāo)準(zhǔn)貯備液8.0 mL 于100.0 mL 容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,配制成濃度為8.0 mg·L-1的SM2 標(biāo)準(zhǔn)工作液。不同質(zhì)量濃度的NEO 與SM2 水溶液配制:分別量取不同體積的100.0 mg·L-1NEO 標(biāo)準(zhǔn)貯備液和100.0 mg·L-1SM2標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10.0 mL 容量瓶中,用超純水定容至10.0 mL,得到不同質(zhì)量濃度的NEO 與SM2 水溶液(NEO 質(zhì)量濃度范圍為0.5～14.0 mg·L-1,SM2 質(zhì)量濃度濃度范圍為0.25 ～9.0 mg·L-1)。鄰苯二甲醛溶液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取鄰苯二甲醛標(biāo)準(zhǔn)品13.4 mg 于100.0 mL 容量瓶中,先用少量超純水溶解,待超聲后,冷卻至室溫,再用超純水定容,配制成濃度為0.001 mol·L-1的鄰苯二甲醛溶液;2-巰基乙醇溶液配制:準(zhǔn)確量取2-巰基乙醇140 μL 于100.0 mL 容量瓶中,用超純水稀釋至刻度,配制成濃度為0.02 mol·L-1的2-巰基乙醇溶液;BR 緩沖液配制:用超純水配制濃度各為0.04 mol·L-1的磷酸、乙酸和硼酸混合緩沖溶液。

1.3.2 不同條件下時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集

1)不同組分的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:①分別取8.0 mg·L-1NEO 水溶液、8.0 mg·L-1SM2 水溶液、8.0 mg·L-1NEO 與SM2 水溶液混合液各2.0 mL 于不同的石英比色皿中。②分別取超純水8.0 mg·L-1NEO水溶液、8.0 mg·L-1SM2 水溶液、8.0 mg·L-1NEO 與SM2 水溶液混合液各1.0 mL 于不同的石英比色皿中,再先后均加入0.5 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液、0.5 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液和0.5 mL BR 緩沖液(pH 值1.8)。對(duì)步驟①、②中的樣品,先采集1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm 下的同步熒光光譜,再采集80min、同步波長(zhǎng)差150 nm 下的同步熒光光譜。

2)不同熒光衍生化時(shí)間和不同同步波長(zhǎng)差時(shí)的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:①分別取8.0 mg·L-1NEO 水溶液、8.0 mg·L-1SM2 水溶液、8.0 mg·L-1NEO與SM2 水溶液混合液各1.0 mL 于不同的石英比色皿中,再先后均加入0.5 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液、0.5 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液和0.5 mL BR 緩沖液(pH 值1.8)。②分別取8.0 mg·L-1NEO水溶液、8.0 mg·L-1SM2 水溶液各1.0 mL 于不同的石英比色皿中,再先后均加入0.5 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液、0.5 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液和0.5 mL BR 緩沖液(pH 值1.8)。對(duì)步驟①中樣品的采集時(shí)間均為1 ～120 min,采集時(shí)間間隔均為1 min,其中采集120 nm 同步波長(zhǎng)差下NEO 水溶液和NEO與SM2 水溶液混合液的同步熒光光譜,采集150 nm同步波長(zhǎng)差下SM2 水溶液和NEO 與SM2 水溶液混合物的同步熒光光譜。對(duì)步驟②中的樣品,分別采集110、115、120、125、130、135、140、145、150、155 和160 nm 同步波長(zhǎng)差下的同步熒光光譜,其中NEO 水溶液采集時(shí)間1～50 min,SM2 水溶液采集時(shí)間1 ～80 min,采集時(shí)間間隔均為1 min。

3)不同鄰苯二甲醛溶液加入量的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:首先,取8.0 mg·L-1NEO 與SM2 水溶液0.5 mL 于不同的石英比色皿中,再先后分別加入不同體積的0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液(0.25、0.50、0.75、1.00 和1.25 mL)、0.25 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液、0.25 mL BR 緩沖液(pH 值1.8)。先采集1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm 下的同步熒光光譜,再采集80 min、同步波長(zhǎng)差150 nm 下的同步熒光光譜。

4)不同2-巰基乙醇溶液加入量的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:首先,取8.0 mg·L-1NEO 與SM2 水溶液0.5 mL 于不同的石英比色皿中,再先后分別加入1.0 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液,不同體積的0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液(0.1、0.2、0.25、0.3 和0.4 mL,pH 值1.8)和0.25 mL BR 緩沖液(pH 值1.8)。先采集1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm 下的同步熒光光譜,再采集80 min、同步波長(zhǎng)差150 nm 下的同步熒光光譜。

5)不同BR 緩沖液加入量的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:首先,取8.0 mg·L-1NEO 與SM2 水溶液0.5 mL 于不同的石英比色皿中,再先后分別加入1.0 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液、0.25 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液及不同體積的BR 緩沖液(0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 和0.4 mL)。先采集1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm 下的同步熒光光譜,再采集80 min、同步波長(zhǎng)差150 nm 下的同步熒光光譜。

6)定量樣品的時(shí)間分辨同步熒光光譜的采集:首先,取不同質(zhì)量濃度的NEO 與SM2 水溶液0.5 mL 于不同的石英比色皿中,再先后加入1.0 mL 0.001 mol·L-1鄰苯二甲醛溶液、0.25 mL 0.02 mol·L-12-巰基乙醇溶液和0.025 mL BR 緩沖液。先采集1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm 下的同步熒光光譜,再采集80 min、同步波長(zhǎng)差150 nm 下的同步熒光光譜。

1.4 熒光光譜儀參數(shù)設(shè)置

使用Cary Eclipse 熒光分光光度計(jì)采集時(shí)間分辨同步熒光光譜。采集參數(shù)如下:同步激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍230～400 nm,PMT 探測(cè)器電壓為700 Ⅴ,激發(fā)和發(fā)射狹縫為10 nm,掃描速度為210 nm·min-1,平滑方式為Moving average。每個(gè)樣品均重復(fù)測(cè)量5 次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

光譜預(yù)處理方法:采用The Unscrambler X 10.4 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,將采集的原始熒光光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入此軟件進(jìn)行基線(xiàn)偏移操作。

同步熒光衰變曲線(xiàn)數(shù)據(jù)處理:提取1 ～50 min 內(nèi)NEO 與鄰苯二甲醛衍生物335 nm 波長(zhǎng)處的同步激發(fā)特征峰,以時(shí)間(min)為X軸、同步波長(zhǎng)差(nm)為Y軸、同步激發(fā)特征峰強(qiáng)度(a.u.)為Z軸,在Origin 2018中建立NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光衰變曲線(xiàn);提取1 ～80 min 內(nèi)SM2 與鄰苯二甲醛衍生物291 nm 波長(zhǎng)處的同步激發(fā)特征峰,以時(shí)間(min)為X軸、同步波長(zhǎng)差(nm)為Y軸、同步激發(fā)特征峰強(qiáng)度(a.u.)為Z軸,在Origin 2018 中建立SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光衰變曲線(xiàn)。

訓(xùn)練集數(shù)據(jù)處理:在10 個(gè)樣本中挑選5 個(gè)樣本作為訓(xùn)練集樣本,以水溶液質(zhì)量濃度X(mg·L-1)為橫坐標(biāo)、同步激發(fā)特征峰的強(qiáng)度Y(a.u.)為縱坐標(biāo),在Origin 2018 中繪制水溶液中NEO 和SM2 的工作曲線(xiàn),并進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

預(yù)測(cè)集數(shù)據(jù)處理:取樣本集中剩下的5 個(gè)樣本作為測(cè)試集樣本,以真實(shí)值(mg·L-1)為橫坐標(biāo)、預(yù)測(cè)值(mg·L-1)為縱坐標(biāo),分別在Origin 2018 中繪制水溶液中NEO 和SM2 的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的關(guān)系曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 時(shí)間分辨同步熒光圖譜

圖2-A、B 分別是采集時(shí)間為1 min、同步波長(zhǎng)差為120 nm 的時(shí)間分辨同步熒光圖譜和采集時(shí)間為80min,同步波長(zhǎng)差為150 nm 的時(shí)間分辨同步熒光圖譜。在同步波長(zhǎng)差為120 nm 時(shí),NEO 衍生體系的同步激發(fā)特征峰是位置在335 nm 波長(zhǎng)處的寬譜峰;在同步波長(zhǎng)差為150 nm 時(shí),SM2 衍生體系的同步激發(fā)特征峰是位置在291 nm 波長(zhǎng)處的寬譜峰。

在1 min 的時(shí)間分辨同步熒光圖譜中超純水體系、NEO 水溶液、SM2 水溶液、NEO 與SM2 水溶液和SM2 衍生體系均無(wú)明顯的熒光峰,NEO 衍生體系和NEO 與SM2 衍生體系具有335 nm 波長(zhǎng)處的熒光峰(圖2-A)。

在80 min 的時(shí)間分辨同步熒光圖譜中超純水體系、NEO 水溶液、SM2 水溶液和NEO 與SM2 水溶液均無(wú)明顯的熒光峰,SM2 衍生體系和NEO 與SM2 衍生體系具有291 nm 波長(zhǎng)處的熒光峰;NEO 衍生體系的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)弱于SM2 衍生體系的熒光強(qiáng)度,且兩者間的特征峰峰位相差很大(圖2-B)。

綜合分析,可以應(yīng)用時(shí)間分辨同步熒光法測(cè)定NEO 與SM2 衍生體系中的NEO 和SM2 含量。

圖2 1 min 時(shí)間分辨同步熒光圖譜(A)與80 min 時(shí)間分辨同步熒光圖譜(B)Fig.2 Time-resolved synchronous fluorescence spectra at 1 min(A)and 80 min(B)

2.2 熒光衍生化時(shí)間及同步波長(zhǎng)差對(duì)水中NEO 和SM2 的同步熒光強(qiáng)度的影響

NEO、SM2 與鄰苯二甲醛反應(yīng)生成異吲哚衍生物。顯然,熒光衍生化時(shí)間會(huì)影響異吲哚衍生物的生成量。在同步掃描過(guò)程中,同步波長(zhǎng)差的選擇將直接影響同步熒光光譜的信號(hào)強(qiáng)度。由圖3 可知,1 ～50 min 內(nèi)隨著熒光衍生化時(shí)間的延長(zhǎng),NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈快速減弱的趨勢(shì)。由圖4-A 可知,隨著同步波長(zhǎng)差的增加,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈先波動(dòng)增強(qiáng)后波動(dòng)減弱的趨勢(shì),在同步波長(zhǎng)差120 nm 時(shí)最強(qiáng)。

由圖3 可知,在1 ～80 min 內(nèi)SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)與NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的趨勢(shì)相反,呈快速增強(qiáng)的趨勢(shì),在80 min時(shí)最強(qiáng)。由圖4-B 可知,隨著同步波長(zhǎng)差增加,SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度與NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的趨勢(shì)相同,呈先波動(dòng)增強(qiáng)后波動(dòng)減弱的趨勢(shì),在同步波長(zhǎng)差150 nm 時(shí)最強(qiáng)。

圖3 NEO 衍生體系和SM2 衍生體系分別在120 和150 nm 波長(zhǎng)差下的同步熒光衰變曲線(xiàn)以及NEO 與SM2 衍生 體系在120 和150 nm 波長(zhǎng)差下同步熒光衰變曲線(xiàn)Fig.3 Synchronous fluorescence decay curves of NEOderived and SM2-derived systems at wavelength differences of 120 and 150 nm,respectively,and synchronous fluorescence decay curves of NEO and SM2 derived systems at wavelength differences of 120 and 150 nm

綜合分析,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物和SM2 與鄰苯二甲醛衍生物在合適的熒光衍生化時(shí)間均具有很強(qiáng)的熒光信號(hào),而它們的熒光衰變趨勢(shì)相反,可以利用這個(gè)特性在時(shí)間上對(duì)兩種物質(zhì)進(jìn)行分辨。本研究選擇NEO 采集時(shí)間1 min、同步波長(zhǎng)差120 nm;SM2 選擇采集時(shí)間80 min、同步波長(zhǎng)差150 nm,進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 不同同步波長(zhǎng)差下NEO 衍生體系同步熒光衰變曲線(xiàn)(A)與SM2 衍生體系同步熒光衰變曲線(xiàn)(B)Fig.4 Synchronous fluorescence decay curve of NEO-derived system(A)as well as SM2-derived system(B)under different synchronous wavelength differences

2.3 鄰苯二甲醛溶液加入量對(duì)水中NEO 和SM2 的同步熒光強(qiáng)度的影響

鄰苯二甲醛是常用的熒光衍生試劑,它在強(qiáng)還原劑存在的條件下會(huì)與NEO 和SM2 的反應(yīng)生成異吲哚衍生物[26]。因此,為提高水中NEO 和SM2 的熒光信號(hào),需要分析鄰苯二甲醛溶液加入量以獲得較優(yōu)的熒光信號(hào)。由圖5 可知,隨著鄰苯二甲醛溶液加入量的增加,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),在鄰苯二甲醛溶液加入量為1.0 mL 時(shí),NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度最佳,但稍弱于SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度。隨著鄰苯二甲醛溶液加入量的增加,SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度則呈快速減弱的趨勢(shì),在鄰苯二甲醛溶液加入量為0.25 mL 時(shí),SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度最佳,但此時(shí)NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度較弱。在分析單一組分時(shí),選擇鄰苯二甲醛溶液加入量的主要依據(jù)是獲得該組分的最佳熒光強(qiáng)度;但在同時(shí)分析兩組分時(shí),不僅要考慮各組分單一的熒光強(qiáng)度,還需要考慮各組分同時(shí)的熒光強(qiáng)度。綜合分析,在鄰苯二甲醛溶液加入量為1.0 mL 時(shí),NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度最佳,且SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度強(qiáng)于NEO 與鄰苯二甲醛衍生物,因此,本研究選擇鄰苯二甲醛溶液加入量為1.0 mL。

有報(bào)道稱(chēng),NEO 與鄰苯二甲醛在堿性環(huán)境下反應(yīng)更加充分,其最適宜反應(yīng)的pH 值在10.5 左右[27]。而SM2 與鄰苯二甲醛在強(qiáng)酸性環(huán)境下反應(yīng)更加充分,其最適宜反應(yīng)的pH 值在1.5 左右[21]。因此,體系的pH值升高會(huì)促進(jìn)NEO 與鄰苯二甲醛反應(yīng),但會(huì)抑制SM2與鄰苯二甲醛反應(yīng)。綜合考慮,本研究用BR 緩沖液將體系調(diào)至偏酸性。在室溫下,鄰苯二甲醛溶液呈中性,加入到體系中,體系的pH 值會(huì)逐漸升高接近中性。

鄰苯二甲醛溶液加入量為0.25 ～1.0 mL 時(shí),隨著鄰苯二甲醛溶液加入量增加,體系的鄰苯二甲醛含量及pH 值均升高,共同促進(jìn)NEO 與鄰苯二甲醛的反應(yīng)。因此,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì);鄰苯二甲醛溶液加入量為1.0 ～1.75 mL時(shí),體系的pH 值變化趨于穩(wěn)定,同時(shí)NEO 與鄰苯二甲醛基本得到充分反應(yīng),此時(shí)鄰苯二甲醛溶液的增加會(huì)降低NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的濃度,進(jìn)而減弱了NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度。

此外,鄰苯二甲醛溶液加入量為0.25 ～1.75 mL時(shí),隨著鄰苯二甲醛溶液加入量增加,體系鄰苯二甲醛含量升高,促進(jìn)了SM2 與鄰苯二甲醛反應(yīng),但是體系pH 值升高,抑制了SM2 與鄰苯二甲醛反應(yīng)(圖5),SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì),此時(shí)抑制作用占據(jù)主導(dǎo)地位。

2.4 2-巰基乙醇溶液加入量對(duì)水中NEO 和SM2 的同步熒光強(qiáng)度的影響

本研究所涉及的熒光衍生化反應(yīng)是以鄰苯二甲醛為衍生劑,2-巰基乙醇為還原劑,NEO 和SM2 與鄰苯二甲醛反應(yīng)生成具有熒光特性的異吲哚衍生產(chǎn)物[20]。因此,優(yōu)化2-巰基乙醇溶液加入量有助于增強(qiáng)NEO和SM2 水溶液衍生體系的熒光信號(hào)。由圖6 可知,隨著2-巰基乙醇溶液加入量的增加,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),在2-巰基乙醇溶液加入量為0.2 mL 時(shí),NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度最佳,此時(shí)SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度約是其四分之三;隨著2-巰基乙醇溶液加入量增加,SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈快速增強(qiáng)趨勢(shì),在鄰苯二甲醛溶液加入量為0.4 mL 時(shí),SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度最佳,但此時(shí)NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度較弱。在2-巰基乙醇溶液加入量為0.25 ～0.3 mL 時(shí),二者的同步熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)相交,此時(shí)這兩種衍生物的同步熒光強(qiáng)度相差不大。綜合分析,在2-巰基乙醇溶液加入量為0.25～0.3 mL 時(shí),這兩種衍生物的同步熒光強(qiáng)度相近;又因同步熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)交點(diǎn)更靠近0.25 mL,所以本研究選擇2-巰基乙醇溶液加入量為0.25 mL。

圖5 不同鄰苯二甲醛溶液加入量對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of different o-phthaldehyde solution additions on synchronous fluorescence intensity

在室溫下,2-巰基乙醇溶液呈酸性,pH 值介于4.5～6.0 之間。2-巰基乙醇溶液加入到體系中,體系的pH 值降低,進(jìn)而抑制NEO 與鄰苯二甲醛反應(yīng),但會(huì)促進(jìn)SM2 與鄰苯二甲醛反應(yīng)。

2-巰基乙醇溶液加入量為0.1～0.2 mL 時(shí),隨著2-巰基乙醇溶液加入量的增加,體系的2-巰基乙醇含量升高,促進(jìn)NEO 與鄰苯二甲醛的反應(yīng),但同時(shí)體系pH 值降低,抑制了NEO 與鄰苯二甲醛的反應(yīng)(圖6),NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì),此時(shí)促進(jìn)作用占據(jù)主導(dǎo)地位;2-巰基乙醇溶液加入量為0.2～0.4 mL 時(shí),隨著2-巰基乙醇溶液加入量的增加,體系pH 值持續(xù)降低引起NEO 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì),此時(shí)抑制作用占主導(dǎo)地位。

此外,2-巰基乙醇溶液加入量為0.1 ～0.4 mL 時(shí),隨著2-巰基乙醇溶液加入量的增加,體系的2-巰基乙醇含量升高及pH 值降低,共同促進(jìn)了SM2 與鄰苯二甲醛的反應(yīng),因此,SM2 與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)。

圖6 不同2-巰基乙醇溶液加入量對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of different 2-mercaptoethanol solution additions on synchronous fluorescence intensity

2.5 BR 緩沖液加入量對(duì)水中NEO 和SM2 的同步熒光強(qiáng)度的影響

溶液pH 值會(huì)在很大程度上影響熒光強(qiáng)度[28],因此,優(yōu)化BR 緩沖液加入量有助于增強(qiáng)NEO 和SM2 水溶液衍生體系的熒光信號(hào)。由圖7 可知,隨著B(niǎo)R 緩沖液加入量的增加,NEO 與鄰苯二甲醛衍生物和SM2與鄰苯二甲醛衍生物的同步熒光強(qiáng)度均呈減弱趨勢(shì)。因此,綜合考慮同步熒光光譜情況,本研究選擇BR 緩沖液加入量為0.025 mL。

圖7 不同BR 緩沖液加入量對(duì)同步熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of different BR buffer additions on synchronous fluorescence intensity

2.6 模型的預(yù)測(cè)與分析

分析采集的含有不同NEO 和SM2 質(zhì)量濃度的樣本熒光光譜發(fā)現(xiàn),隨著NEO 和SM2 質(zhì)量濃度的增加,兩者的同步熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。因此,以同步激發(fā)特征峰強(qiáng)度為依據(jù)分別對(duì)水中NEO 和SM2 的含量進(jìn)行定量分析。

分析含不同NEO 質(zhì)量濃度為0.5 ～14.0 mg·L-1的樣本熒光光譜強(qiáng)度,不同NEO 濃度與其對(duì)應(yīng)濃度在335 nm 波長(zhǎng)處同步激發(fā)特征峰強(qiáng)度的關(guān)系曲線(xiàn)如圖8-A 所示,呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性方程為Y=14.73X+6.14,訓(xùn)練集決定系數(shù)(R2C)為0.997 5,檢出限為0.5 mg·L-1。為驗(yàn)證研究的可靠性并進(jìn)一步預(yù)測(cè)分析,對(duì)含不同NEO 濃度(2.0、3.0、6.0、7.0 和13.0 mg·L-1)的樣本進(jìn)行回收試驗(yàn),由圖8-C 可知,預(yù)測(cè)集樣本中NEO 含量的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的的決定系數(shù)(R2P)為0.998 2,均方根誤差(root mean square error of prediction,RMSEP)為0.380 3 mg·L-1。對(duì)預(yù)測(cè)樣本進(jìn)行回收試驗(yàn),樣本回收率處于101.8%～114.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為4.0%～8.4%(n=5)(表1)。

圖8 水中NEO(A、C)和SM2(B、D)的工作曲線(xiàn)和預(yù)測(cè)集樣本關(guān)系圖Fig.8 Working curves aqueous solutions and sample relation of prediction set diagrams of NEO(A,C)and SM2(B,D)

表1 水中NEO 和SM2 的回收率與精密度Table 1 Recovery rate and precision degree of neomycin and sulfadimidine in water

分析含不同SM2 質(zhì)量濃度為0.25～9.0 mg·L-1的樣本的熒光光譜強(qiáng)度,不同SM2 濃度與其對(duì)應(yīng)濃度在291 nm 波長(zhǎng)處同步激發(fā)特征峰強(qiáng)度的關(guān)系曲線(xiàn)(圖8-B),呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性方程為Y= 13.86X+21.49,R2C為0.966 9,檢出限為0.25 mg·L-1。對(duì)含不同SM2 濃度(2.0、3.0、6.0、7.0 和8.0 mg·L-1)的樣本進(jìn)行回收試驗(yàn)。由圖8-D 可知,預(yù)測(cè)集樣本中SM2 含量的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的R2P為0.988 9,RMSEP 為0.257 5 mg·L-1。對(duì)預(yù)測(cè)樣本進(jìn)行回收試驗(yàn),樣本回收率處于92.3%～115.8%之間,RSD 為3.6%～6.6%(n=5)(表1)。

由檢測(cè)結(jié)果可知,基于本研究的時(shí)間分辨同步熒光法應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)水中NEO 和SM2 含量,能得到較好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 討論

隨著我國(guó)抗生素生產(chǎn)和使用量的持續(xù)增長(zhǎng),水中抗生素的污染越來(lái)越嚴(yán)重。目前,國(guó)內(nèi)外研究水中NEO 和SM2 含量檢測(cè)的方法主要采用液相色譜法,如王欣梅等[29]以液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了環(huán)境水樣中SM2 的含量,檢出限為0.06 ng·L-1;Miao 等[30]以微內(nèi)徑柱高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)了污水處理廠出廠水中NEO 含量,檢出限為2.0 pg·L-1。雖然本檢測(cè)方法的檢出限高于液相色譜法的檢出限,但本研究所采用的方法操作更加方便、快捷,且設(shè)備體積較小,具有現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

由于各組分熒光光譜常會(huì)產(chǎn)生重疊,普通熒光法在混合體系中的檢測(cè)應(yīng)用難以用于定量分析。與普通熒光法相比,同步熒光法在分析一些光譜重疊、難以分辨的復(fù)雜混合物中更具有優(yōu)勢(shì)。目前,同步熒光分析在混合體系熒光分析中已有較多應(yīng)用。如莊宇等[31]提出了基于同步熒光結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)同時(shí)測(cè)定3 種抗生素(乳酸環(huán)丙沙星、乳酸左氧氟沙星、鹽酸左氧氟沙星)的方法;張晶玉等[32]進(jìn)行了基于同步、導(dǎo)數(shù)和卡爾曼濾波熒光法的羅丹明B 和羅丹明6G 同時(shí)測(cè)定的比較研究,發(fā)現(xiàn)應(yīng)用同步熒光法效果最佳。此外,對(duì)于光譜重疊但熒光壽命有差異的混合體系還可以采用時(shí)間分辨熒光法進(jìn)行檢測(cè)。如Leivo 等[33]以時(shí)間分辨熒光和熒光免疫法檢測(cè)了牛奶中氟喹諾酮含量;張笑河等[34]提出了一種時(shí)間分辨熒光法同時(shí)測(cè)定混合液(己酸乙酯和乙酸乙酯)中各組分濃度的方法。本研究結(jié)合同步熒光法和時(shí)間分辨熒光法,針對(duì)水中NEO 和SM2 的含量建立了時(shí)間分辨同步熒光檢測(cè)方法,為熒光分析法實(shí)現(xiàn)水中NEO 和SM2 含量的快速、在線(xiàn)和精確檢測(cè)提供了一定的借鑒。熒光分析法在檢測(cè)水中NEO 和SM2 含量中的應(yīng)用仍存在一定的局限性,本研究所能達(dá)到的靈敏度、準(zhǔn)確度有限,還需要對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行完善和優(yōu)化,有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

利用同步熒光光譜法結(jié)合時(shí)間分辨、化學(xué)計(jì)量學(xué)等方法,建立了線(xiàn)性模型預(yù)測(cè)水中NEO 和SM2 的含量,并對(duì)同步波長(zhǎng)差、熒光衍生化時(shí)間、鄰苯二甲醛溶液加入量、2-巰基乙醇溶液加入量和BR 緩沖液加入量進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果得到水中不同濃度的NEO 回收率101.8%～114.0%,RSD 為4.0%～8.4%;水中不同濃度的SM2 回收率為92.3%～115.8%,RSD 為3.6%～6.6%。表明采用時(shí)間分辨同步熒光法能可有效分辨NEO 和SM2 的鄰苯二甲醛衍生物之間的同步熒光光譜,可有效篩選出同步激發(fā)特征峰,使水中NEO 和SM2 含量同時(shí)被檢測(cè),同時(shí)簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟,為水中NEO 和SM2 含量同時(shí)快速檢測(cè)提供了一種新的方法。