趙麗麗 王小利 陳 超 董 瑞

(1貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系,貴州 貴陽 550025;2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

氮(N)是植物生長和發(fā)育中最重要的營養(yǎng)元素之一,也是植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)、核酸、酶、葉綠素等物質(zhì)的主要組成成分,其可占植物干物質(zhì)總量的1%～5%[1]。世界范圍內(nèi)的耕作土壤普遍存在氮素缺乏的現(xiàn)象,而外施氮肥是提高作物產(chǎn)量的主要農(nóng)藝措施之一[2]。氮肥對(duì)作物產(chǎn)量的貢獻(xiàn)約為45%[3]。研究表明,適量的氮可增強(qiáng)作物的耐鹽性[4]。而過量施用氮肥,由于氮未被植物完全吸收利用,會(huì)造成硝酸鹽積累,引起土壤、水和空氣的氮污染,導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、抗病蟲和抗倒伏能力降低[5-6]。程慧煌等[7]研究表明,過量施用氮肥會(huì)增加雜交水稻的倒伏率。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前我國氮肥年施用量已達(dá)2 500 萬t,是世界平均水平的3 倍,但氮肥利用效率(nitrogen utilization efficiency,NUE)較低,僅30%左右[8]。因此,提高氮肥利用率,減少氮肥施用對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。

在自然界中,硝酸鹽(NO3-)是影響植物生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)的主要因素。因此,硝酸鹽信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)是植物響應(yīng)環(huán)境信號(hào)的核心因素[9]。植物可以同時(shí)利用土壤中的無機(jī)氮和有機(jī)氮,其中硝酸鹽是大多數(shù)作物吸收和利用的主要形式[10]。但土壤中NO3-濃度在時(shí)間和空間上通常劇烈波動(dòng),已成為限制作物生長和產(chǎn)量提高的主要因素之一[11]。植物能夠根據(jù)自身內(nèi)部氮含量和外部NO3-有效性的變化快速調(diào)節(jié)對(duì)NO3-的獲取效率[12]。尤其是整株植物在低氮狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致根中NO3-吸收系統(tǒng)的快速上調(diào),并刺激根系生長以改善對(duì)土壤中氮的吸收效率[13]。硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nitrate transporters,NRTs)包括NRT1 和NRT2兩個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,其主要功能是負(fù)責(zé)植物根系對(duì)NO3-的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。其中NRT1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(low affinity transport system,LATS),NRT2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(high affinity transport system,HATS)[15-16]。NRT 家族對(duì)硝態(tài)氮的親和性會(huì)影響植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力[17]。前人在高等植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NRT1 和NRT2 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族有多個(gè)亞型。如,在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中已經(jīng)鑒定出8 個(gè)NRT1和7 個(gè)NRT2 的基因亞型[18];在水稻(Oryza sativa)中,已經(jīng)報(bào)道的NRT基因達(dá)100 多個(gè),且多數(shù)為NRT1 家族蛋白[14]。

高羊茅(Festuca arundinacea)為禾本科多年生植物,是溫帶地區(qū)廣泛種植的冷季型草坪草和牧草[19]。目前,已有關(guān)于高羊茅吸收利用氮素的生理特性以及氮脅迫下的蛋白組學(xué)的研究報(bào)道[20-21],但關(guān)于氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族NRT1 和NRT2 對(duì)高羊茅耐低氮機(jī)理的研究尚鮮見報(bào)道。本研究利用 cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)獲得了高羊茅NRT1.1 基因全長,并對(duì)其編碼蛋白的序列特征及在不同脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,旨在為高羊茅耐低氮相關(guān)基因的功能和機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以貴州省草業(yè)研究所育成的黔草1 號(hào)高羊茅(登記號(hào):299)為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇飽滿的高羊茅種子,置于50℃蒸餾水中浸泡過夜,用75%酒精浸泡30 s,無菌水沖洗3 次,然后用0.1% HgCl2浸泡4 min,無菌水沖洗5 ～6 次。將消毒后的種子置于培養(yǎng)皿中,放入光照培養(yǎng)箱(光周期為16 h 光照/8 h 黑暗,恒溫22℃)中發(fā)芽7 d。發(fā)芽后轉(zhuǎn)置于Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)并進(jìn)行不同脅迫處理。

1)低氮處理:將發(fā)芽后7 d 的健康高羊茅植株分別轉(zhuǎn)移至無氮(營養(yǎng)液中NO3-被Cl-取代)、正常供氮(按照標(biāo)準(zhǔn)Hoagland 營養(yǎng)液配方配置)水培液中進(jìn)行24 h 處理。

2)高鹽處理:取發(fā)芽后7 d 的高羊茅植株放置于含有400 mmol·L-1NaCl 的Hoagland 營養(yǎng)液中處理24 h。

3)高溫處理:將發(fā)芽后7 d 的高羊茅植株在42℃持續(xù)處理24 h。

4)干旱處理:采用模擬干旱的方法,將發(fā)芽后7 d的高羊茅植株置于30% PEG 6000(滲透勢(shì)為-1.0 MPa)溶液中處理24 h。

分別于處理后0、0.5、1、2、6、12、24 h 對(duì)全部對(duì)照組和處理組高羊茅進(jìn)行采樣,剪取葉片,液氮速凍,-80℃保存待用。

1.3 RNA 提取及cDNA 合成

按照TRIzol RNA 試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,美國)說明書提取高羊茅葉片中的總RNA;按照RNase Free DNase Ⅰ試劑盒(TaKaRa,日本)說明書對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行處理,去除殘留基因組DNA。按照PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒(TaKaRa,日本)說明書將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 高羊茅NRT1 基因的克隆

依據(jù)GenBank 中檢索到的擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1.1(At1g12110)基因序列,將其與高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST 比對(duì),獲取高羊茅中的同源序列,并依據(jù)此序列,利用Primer 6.0 設(shè)計(jì)3′RACE、5′RACE的特異性引物及擴(kuò)增NRT1.1 基因全長序列的引物(表1)。按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0(Invitrogen,美國)試劑盒說明書獲得該基因的5′端序列,將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化;按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech,美國)試劑盒說明書獲得該基因的3′端序列,將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。純化后的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司直接測(cè)序并進(jìn)行全長拼接。

1.5 序列生物信息學(xué)分析

利用NCBI 進(jìn)行開放閱讀框的查詢,通過BLAST 進(jìn)行同源性分析,采用MEGA6 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[16]。采用Protparam(https:/ /web.expasy.org/protparam/)在線程序預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的理化性質(zhì);通過ProtScale(https:/ /web.expasy.org/protscale/)在線程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)疏水性/親水性;采用在線軟件SOPMA(https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 表達(dá)模式分析

以高羊茅葉片mRNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板,采用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)低氮、干旱、熱、鹽脅迫不同處理時(shí)段高羊茅葉片NRT1.1 基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。NRT1.1 基因用于RT-qPCR 的引物序列為NRT1-F:CGCAGGTGGAGCAAGTGAAG 和NRT1-R:AAGACGACGGAGTAGAGGATGG。內(nèi)參基因?yàn)閁BI,引物序列為UBI-F:CACCTCGATCACCCACCT CT 和UBI-R:AGGGTCTCCGATAACCTCCA。反應(yīng)體系及程序按照Power 2 × SYBR Real-time PCR premixture(Baomanbio,美國)說明書進(jìn)行。采 用2-ΔΔCT法[17]計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Mircosoft Office Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用SPSS 22.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅NRT1 基因cDNA 全長的克隆及分析

以高羊茅的總cDNA 為模板,使用3′RACE 引物3′810-1 和3′810-2 進(jìn)行巢式PCR,獲得1 條大小為1 208 bp 的片段(圖1-A)。以5′RACE 引物A219-1(GSP1)、A219-2(GSP2)和A219-3(GSP3)進(jìn)行巢式PCR,擴(kuò)增出1 條大小為823 bp 的片段(圖1-B)。對(duì)3′端和5′端進(jìn)行拼接測(cè)序,獲得了序列全長為2 328 bp 的高羊茅硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1,含1 848 bp 的開放閱讀框,共編碼氨基酸606 個(gè)(圖1-C、圖2)。預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為193.9 kDa,理論等電點(diǎn)為4.81,不穩(wěn)定系數(shù)為58.64,為不穩(wěn)定蛋白;脂肪系數(shù)為19.12,平均親水性為0.919。應(yīng)用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該蛋白含有約32.63%α-螺旋,7.63%β-轉(zhuǎn)角和53.73%不規(guī)則卷曲。

將高羊茅NRT1.1 與GenBank 中登錄的其他物種的部分NRT1.1 家族成員基因序列進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建進(jìn)化樹。由圖3 可知,NRT1.1 基因可以分成3 支:雙子葉植物(A)、單子葉植物(B)、起源古老(C)?；蛐蛄斜葘?duì)表明,高羊茅NRT1.1 與黑麥草NRT1.1 具有較高的同源性,與黑麥草(Lolium perenne)、小 麥(Triticumaestivum)、短柄草(Brachypodium distachyon)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max),蕪菁(Brassica rapa)、擬南芥、番 茄(Solanum lycopersicum)、高 粱(Sorghum bicolor)、水稻、玉米(Zea mays)的同源性分別為49%、45%、42%、38%、37%、37%、35%、33%、30%、22%、14%。

圖1 高羊茅NRT1.1 PCR 擴(kuò)增電泳Fig.1 PCR product of NRT1.1 gene in F.arundinacea

2.2 高羊茅NRT1.1 基因表達(dá)模式分析

由圖4 可知,氮脅迫處理組的NRT1.1 基因在脅迫0.5 h 時(shí)被顯著誘導(dǎo),脅迫1 h 時(shí)NRT1.1 相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值(21.76),顯著高于對(duì)照及其他處理,是對(duì)照組的35 倍,而在脅迫2 h 后氮處理組NRT1.1 基因的表達(dá)受到顯著抑制,在脅迫6 ～24 h 呈無規(guī)律波動(dòng),且在脅迫24 h 時(shí),氮處理組的NRT1.1 基因表達(dá)顯著低于對(duì)照,僅約為對(duì)照的20%。在干旱脅迫條件下,脅迫1 h 內(nèi)對(duì)照和干旱處理組之間NRT1.1 基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著,在脅迫2、6 h 時(shí)干旱處理組NRT1.1 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照,分別是對(duì)照的2.26 和1.63 倍,但在脅迫12 h 時(shí)二者的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì),且差異不顯著,而在脅迫24 h 時(shí)干旱處理組相對(duì)表達(dá)量再次升高,且顯著高于對(duì)照,是對(duì)照的2.5 倍。在熱脅迫條件下,處理開始時(shí)對(duì)照和熱處理組NRT1.1 基因的表達(dá)均受到了抑制,但是隨著脅迫時(shí)間的延長,二者的表達(dá)量均逐漸升高,在脅迫12 h時(shí)達(dá)到峰值后又開始下降,除了脅迫0 h 和1 h 時(shí),其他處理時(shí)間熱處理組表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。在鹽脅迫條件下,對(duì)照的NRT1.1 基因表達(dá)始終受到抑制,雖有波動(dòng),但均顯著低于0 h 時(shí)的表達(dá)量,處理組在脅迫0.5～24 h 時(shí)NRT1.1 相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)低-高-低的趨勢(shì),在脅迫6 h 時(shí)達(dá)到峰值(1.22),是對(duì)照的3.98 倍,表明熱脅迫處理組NRT1.1 基因表達(dá)在開始時(shí)受到抑制,然后被誘導(dǎo)表達(dá),但隨著時(shí)間的延長再次受到抑制。

圖3 部分物種NRT1.1 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the NRT1.1 gene from several plant species

圖4 氮、干旱、熱和鹽處理后高羊茅根中NTR1 基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expressions of NRT1 gene in roots of F.arundinacea plant under nitrogen,drought,heat and salt treatment

3 討論

NRT1.1(CHL1)是在植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定的首個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因[22]。目前,對(duì)NRT1.1 的研究主要集中在模式植物擬南芥以及糧食作物水稻[14]和小麥[16]中,而有關(guān)NRT基因家族在高羊茅中的表達(dá)情況鮮見報(bào)道。本研究成功從高羊茅中克隆到1 個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1.1。研究發(fā)現(xiàn),NRT1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一般包含450～600 個(gè)氨基酸[23]。高羊茅蛋白NRT1.1 由606個(gè)氨基酸構(gòu)成,與前人研究結(jié)果基本一致[23]。研究表明,NRT1 和NRT2 家族的基因亞型數(shù)目具有物種特異性,且基因表達(dá)還具有器官特異性[16]。本研究通過比對(duì)發(fā)現(xiàn),高羊茅NRT1.1 基因的核苷酸和氨基酸序列與其他植物NRT1 的一致性較低,其中與黑麥草的一致性最高,為49%,其次為小麥(45%)和短柄草(42%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,高羊茅NRT1.1基因與黑麥草、玉米和小麥等禾本科植物有較高的同源性,與大豆、葡萄等作物的關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

本試驗(yàn)中,實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明,高羊茅NRT1.1 基因的表達(dá)在低氮脅迫處理0.5 h 時(shí)開始顯著升高,表明低濃度氮可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)NRT1.1表達(dá)至峰值,高羊茅NRT1.1 應(yīng)該是誘導(dǎo)型基因,其表達(dá)模式與茶樹CsNRT1.1[24]和白菜BcNRT2[15]基因類似。Guo 等[25]對(duì)擬南芥的雙親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNRT1.1(CHL1)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)與野生型植物相比,CHL1 突變體表達(dá)量顯著高于野生型,且會(huì)導(dǎo)致CHL1 突變體的耐旱性增強(qiáng)。前人對(duì)小麥進(jìn)行缺氮和干旱處理,發(fā)現(xiàn)缺氮和干旱脅迫會(huì)顯著抑制小麥幼苗地上部分生長,導(dǎo)致生理活性降低,植物體內(nèi)氮代謝紊亂,且干旱處理下小麥TaNRT1.1 和TaNRT1.2 基因的表達(dá)顯著低于缺氮處理下的表達(dá)量[26-27]。本研究中高羊茅NRT1 基因的表達(dá)量也表現(xiàn)為干旱和熱處理?xiàng)l件下低而氮處理?xiàng)l件下高,表明干旱或熱處理會(huì)引起高羊茅植株生理活性降低,從而使NRT1 基因的表達(dá)量降低。

蘇莉[27]對(duì)鹽處理下的番茄進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)LeNRT1.1 和LeNRT1.2 的表達(dá)水平顯著降低;LeNRT2.1 的表達(dá)水平也下降,但差異不顯著,LeNRT2.3 的表達(dá)量在鹽處理12 h 后略有增加。而Yao 等[28]對(duì)鹽處理下野生耐鹽西紅柿(S.pennellii)和栽培番茄(S.lycopersicum)研究發(fā)現(xiàn),其根組織中NRT1.1、NRT2.1 和NRT2.3 的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì),而NRT1.2 呈現(xiàn)升高趨勢(shì)這與本研究結(jié)果一致。此外,NRT1 不僅可作為硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,還可能是植物感受硝酸鹽的信號(hào)受體[24]。高羊茅NRT1.1 基因的核苷酸和氨基酸序列與其他植物NRT1.1 的一致性較低。因此,對(duì)高羊茅硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1.1 的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究和鑒定。

4 結(jié)論

本研究采用RACE 技術(shù)對(duì)高羊茅NRT1.1 基因cDNA 全長序列進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)得序列全長2 328 bp,編碼606 個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為193.9 kDa。進(jìn)一步分析表明,與高羊茅NRT1.1 基因序列相似性最高的為黑麥草NRT1.1(49%)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表達(dá)分析顯示,低氮、干旱和熱脅迫處理時(shí),高羊茅葉片NRT1.1 表達(dá)量均顯著提高,但其受低氮誘導(dǎo)速度快于干旱和熱脅迫,鹽脅迫則對(duì)NRT1.1 表達(dá)有一定的抑制。本研究為解析高羊茅NRT1.1 基因的表達(dá)模式奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。