蘇利佳，蘇華華，王艷華，趙金映

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 形態(tài)學(xué)系，湖北 宜昌 443002

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，臨床確診時多數(shù)病情已進(jìn)入晚期，預(yù)后極差[1]。尋找有益于胃癌早期確診的新途徑，將極大地改善胃癌患者的預(yù)后。其中，microRNA（miRNA）分子的結(jié)構(gòu)及其在腫瘤進(jìn)程中的功能引起了學(xué)者們廣泛關(guān)注。這些由19～25個核苷酸組成的小分子可通過與靶基因3′非翻譯區(qū)的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯而調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、運(yùn)動和侵襲中發(fā)揮重要作用[2-3]。

在這些miRNA分子中，miR-21參與胃癌的病理進(jìn)程。miR-21定位于染色體17q23.2，緊鄰空泡膜蛋白 1（vacuole membrane protein 1，VMP1）基因，在核糖核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ作用下，miR-21的前體pre-miR-21被剪切成前導(dǎo)鏈miRNA-21-5p和后隨鏈miRNA-21-3p[4]。miR-21分子在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)狀態(tài)，它能與多種靶基因，如富含AT的特異性序列結(jié)合蛋白1（special AT-rich sequence-binding protein-1，SATB1）、程序性細(xì)胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）、人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）、凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）、金屬蛋白酶抑制因子3（metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3）和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）相互作用，進(jìn)而激活腫瘤增殖信號，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤遷移[5]。此外，miR-21還可作為胃癌診斷標(biāo)志物，用于評估胃癌的臨床分期、分級及預(yù)后[6]。在此，我們就miR-21分子作為胃癌標(biāo)志物、與胃癌增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以及miR-21分子抑制劑研究進(jìn)展做簡要總結(jié)，通過梳理miR-21與胃癌間的相互關(guān)系，為胃癌研究相關(guān)學(xué)者提供參考。

1 miR-21可作為胃癌標(biāo)志物

先前研究已發(fā)現(xiàn)miRNA在結(jié)構(gòu)上高度保守，穩(wěn)定地存在于各種體液中，可以作為疾病的生物標(biāo)志物[7]。并且miRNA廣泛存在于人體組織及體液中，各種疾病的不同狀態(tài)下miRNA的表達(dá)情況也不同，因此臨床醫(yī)生或科研人員可以通過檢測體液中的miRNA水平來診斷疾病和評估預(yù)后。Xu等[8]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-21-3p和miR-21-5p的表達(dá)均高于癌旁組織，在腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段，miR-21-3p和miR-21-5p均為高表達(dá)水平。miR-21-3p和miR-21-5p可作為胃癌診斷的潛在生物標(biāo)志物，但在判斷胃癌Ⅱ或Ⅲ期TNM分期中，miR-21-5p在區(qū)分腫瘤分化程度方面更有優(yōu)勢。

胃癌患者外周血中miR-21相對水平也顯著高于健康人群，可作為胃癌血清學(xué)篩查的分子標(biāo)志物[9]。miR-21與各臨床病理特征均無相關(guān)性，但miR-21的高表達(dá)可影響胃癌的發(fā)生和患者的生存時間。如有學(xué)者選取胃癌患者50例，采集患者外周血標(biāo)本，并以50例健康人作為對照，對比研究miR-21和miR-182基因在胃癌患者外周血和胃癌組織中的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中miR-21和miR-182的相對表達(dá)水平明顯高于正常健康人，且miR-21和miR-182的高表達(dá)預(yù)示著患者的生存時間縮短。

miR-21表達(dá)水平與胃癌預(yù)后關(guān)系密切。Sierzega等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-130a、miR-331、miR-19a、miR-223、miR-106a、miR-21和miR-374在原發(fā)性腫瘤中過表達(dá)。而Obermannova等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-10b、miR-21、miR-93和miR-107的表達(dá)水平明顯高于非腫瘤組織，miR-10b、miR-21、miR-145表達(dá)升高與胃癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。Emami等[12]采用Real time PCR檢測了30例胃癌患者和30例健康對照者血漿中miR-21和miR-222的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿中miR21和miR222的表達(dá)水平明顯高于對照組，因而他們認(rèn)為外周血循環(huán)中miR-21和miR-222水平可以作為胃癌診斷標(biāo)志物。

miR-21還可作為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物。臨床研究發(fā)現(xiàn)，超過一半以上的胃癌晚期患者在根治性切除術(shù)后發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，是晚期胃癌患者死亡的首要原因之一[13]。Soeda等[14]研究了外泌體包裹的miRNA（ex-miRNA）在接受根治性手術(shù)的胃癌患者中作為微創(chuàng)生物標(biāo)記物的有效性，發(fā)現(xiàn)miR-21與PDCD4的mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，并且miR-92a與前列腺素E受體4的mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。研究提示胃癌腹膜復(fù)發(fā)者與無腹膜復(fù)發(fā)者的ex-miR-21和ex-miR-92a水平有明顯差異，因此ex-miR-21和ex-miR-92a可能成為預(yù)測Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者腹膜復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效的微創(chuàng)生物標(biāo)志物。

miR-21參與PD-1/PD-L1通路介導(dǎo)的胃癌術(shù)后Th17/Treg細(xì)胞失衡。Zheng等[15]發(fā)現(xiàn)胃癌切除術(shù)后的患者Th17細(xì)胞減少，Treg細(xì)胞增多，PD-1/PD-L1表達(dá)增加；并且RORt和IL-17表達(dá)降低，而Foxp3和TGF-1表達(dá)升高。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過Ad-sh-PD1沉默PD-1可以促進(jìn)miR-21的表達(dá)，增加Th17細(xì)胞百分比，降低Treg細(xì)胞百分比。因此，miR-21的過表達(dá)增加了Th17細(xì)胞百分比，降低了Treg細(xì)胞百分比。這表明miR-21參與PD-1/PD-L1通路介導(dǎo)的胃癌術(shù)后Th17/Treg細(xì)胞失衡，如能有效監(jiān)測胃癌切除術(shù)后患者miR-21表達(dá)水平，維持Th17/Treg細(xì)胞平衡，可有效改善患者預(yù)后。然而，當(dāng)前的研究仍存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計分析方法標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，樣本量較小的問題。如果合理應(yīng)用檢測手段監(jiān)測其體內(nèi)水平，即可將miR-21作為良好的胃癌診斷指標(biāo)。

2 miR-21參與胃癌病理進(jìn)程

研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可負(fù)調(diào)控Smad7基因，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[16]。而Smad7是Smad家族成員，屬于TGF-β超家族配體，參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抑癌因子的作用。Smad7可以通過阻止Smad2/Smad4復(fù)合物的形成來阻斷TGF-β信號的形成。Jiang等[17]研究表明Smad7在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平降低，而敲除miR-21-5p基因后，Smad7基因表達(dá)上調(diào)，且SGC-7901細(xì)胞的增殖能力顯著下降。另一項(xiàng)有關(guān)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的研究也發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-21-5p可以靶向下調(diào)Smad7的表達(dá)，從而誘導(dǎo)HMRSV5細(xì)胞的間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT），促進(jìn)胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移[18]。Xiao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，用miR-21模擬物轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞后，miR-21的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進(jìn)展。然而，轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制劑后E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)增多，胃癌細(xì)胞的EMT受到抑制。因此推測，在胃癌中miR-21的過表達(dá)可以通過沉默Smad7促進(jìn)TGF-β途徑，從而啟動MMT，也可通過EMT影響胃癌細(xì)胞的遷移能力。

miR-21-5p促進(jìn)胃癌的能量代謝[20]。Liu等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在胃癌組織中顯著上調(diào)，PDHA1在胃癌中的表達(dá)明顯下調(diào)，兩者表達(dá)程度為負(fù)相關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-21-5p模擬物的胃癌細(xì)胞乳酸產(chǎn)生增加，而轉(zhuǎn)染其抑制劑的細(xì)胞乳酸產(chǎn)生減少，以上結(jié)果提示miR-21在胃癌中可能通過促進(jìn)糖酵解，使胃癌細(xì)胞乳酸增加，具有促癌作用。進(jìn)一步研究兩者的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p能促進(jìn)空白對照細(xì)胞的糖酵解，但不能促進(jìn)PDHA1過表達(dá)細(xì)胞的糖酵解。而在抑制PDHA1表達(dá)的細(xì)胞中，miR-21-5p未能進(jìn)一步增加糖酵解水平，說明miR-21-5p可以通過靶向調(diào)控PDHA1進(jìn)而調(diào)節(jié)糖酵解，并且PDHA1的下調(diào)會促進(jìn)胃癌糖酵解和從而影響胃癌的增殖分化。因此，通過調(diào)控miR-21-5p/PDHA1軸可以影響胃癌的糖酵解和進(jìn)展過程是可行的。

miR-21參與激活胃癌增殖轉(zhuǎn)移信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Zhou等[22]發(fā)現(xiàn)沉默miR-21顯著抑制了胃癌細(xì)胞的遷移和運(yùn)動，這可能與波形蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)miR-21的下調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。進(jìn)一步的研究表明，miR-21的下調(diào)使PTEN蛋白表達(dá)增加，但PTEN mRNA的表達(dá)無明顯變化，進(jìn)而降低了胃癌細(xì)胞中Akt的磷酸化。因此，miR-21可以通過調(diào)控PTEN/Akt信號通路來影響人胃癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動和凋亡，有望成為治療胃癌的靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-21可通過下調(diào)Smad7、PTEN、PDHA1信號，激活EMT進(jìn)程，促進(jìn)胃癌惡性發(fā)展。

3 抑制miR-21的相關(guān)研究

干擾或抑制miR-21信號的途徑有miRNA抑制劑，病毒介導(dǎo)的pre-miRNA、sh-pre-miRNA，干細(xì)胞分泌的外泌體，以及人工包裝miRNA的外泌體[23]。miRNA抑制劑在治療腫瘤疾病中具有以下優(yōu)勢：首先，miRNA易穿過細(xì)胞膜；其次，由于缺少polyA尾，miRNA不具有免疫原性，不引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)；第三，這些分子在體外和體內(nèi)都相當(dāng)穩(wěn)定，可以通過對它們的進(jìn)一步修飾以延長其生物半衰期。因此，有效開發(fā)miR-21抑制劑成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。除了通過抑制miR-21表達(dá)激活PTEN/PI3K/mTOR信號軸外[24]，抑制miR-21分子功能的途徑還有以下3種方式。

3.1 受體蛋白相關(guān)抑制作用

FZD6（frizzled6）是卷曲基因家族的一員，是非典型的Wnt信號蛋白的受體。越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)ZD6參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是腫瘤細(xì)胞體外增殖和遷移的重要調(diào)控因子[25]。Yan等[26]發(fā)現(xiàn)FZD6的過表達(dá)可以靶向抑制miR-21的促癌作用，與典型和非典型Wnt途徑中miR-21依賴的效應(yīng)相關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD6在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系SGC7901、AGS中的表達(dá)較正常胃組織和正常胃上皮細(xì)胞系GES-1下調(diào)。而集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，促進(jìn)FZD6表達(dá)可顯著抑制腫瘤生長，Transwell實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)FZD6的表達(dá)上調(diào)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。而轉(zhuǎn)染si-FZD6的胃癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染si-Control的細(xì)胞相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖和遷移能力。FZD6通過激活非典型的Wnt途徑來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，F(xiàn)ZD6具有靶向miR-21來抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。

3.2 環(huán)狀RNA相關(guān)抑制作用

circHIAT1是一種重要的具有潛在抗腫瘤功能的環(huán)狀RNA（circRNA），已被證明在腎癌中具有腫瘤抑制作用。Quan等[27]發(fā)現(xiàn)circHIAT1可以抑制miR-21在胃癌中的促癌作用，胃癌組織中circHIAT1的表達(dá)明顯低于癌旁組織。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）作為一種有絲分裂原活化的蛋白激酶通路，與胃癌細(xì)胞的生長和分化有關(guān)。PLCDH-circHIAT1轉(zhuǎn)染MKN28和MKN45細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降，p53、p21表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT是經(jīng)典的生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)著許多生物學(xué)過程，如增殖和凋亡。AKT通路在胃癌中經(jīng)常被激活以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長，而PTEN通過抑制PI3K負(fù)向調(diào)節(jié)AKT通路。circHIAT1可以通過使miR-21表達(dá)下調(diào)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和EMT，并且抑制PTEN/PI3K/AKT和ERK信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.3 lncRNA相關(guān)抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，在miRNA上長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）與mRNA有著共同結(jié)合位點(diǎn)，lncRNA可通過結(jié)合相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)吸附miRNA，作為內(nèi)源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNA競爭性結(jié)合，消除miRNA的下游效應(yīng)[28]。Li等[29]發(fā)現(xiàn)lncRNA生長特異抑制物5（growth arrest-specific 5，Gas5）在胃癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miR-21在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞MKN45、MKN7和SGC-7901中Gas5的表達(dá)明顯下調(diào)，miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)。雙重螢光素酶報告顯示miR-21降低了含有野生型3′非翻譯區(qū)的Gas5的螢光素酶活性，但沒有降低含有突變型3′非翻譯區(qū)的Gas5的螢光素酶活性，這表明miR-21是MKN45細(xì)胞中Gas5的靶基因。Gas5的過表達(dá)和miR-21的抑制顯著抑制了MKN45的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡，Gas5過表達(dá)和miR-21抑制顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低了胃癌細(xì)胞的耐藥性，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。Gas5轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，miR-21的表達(dá)明顯降低，胃癌細(xì)胞的遷移受到明顯抑制，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，過表達(dá)Gas5靶向抑制miR-21表達(dá)，顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和成瘤，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

母體表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）是一種lncRNA，也是一種抑癌因子，在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。Xu等[30]通過qRTPCR檢測發(fā)現(xiàn)胃癌組織和細(xì)胞系中MEG3表達(dá)下調(diào)，miR-21表達(dá)上調(diào)，miR-21的表達(dá)受MEG3的負(fù)調(diào)控?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一類功能相關(guān)的含鋅酶家族，能降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞侵襲。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管生成中起重要作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染lncRNA-MEG3的胃癌細(xì)胞與對照組相比細(xì)胞間接觸更為緊密。MEG3的過表達(dá)降低了MMP-3、MMP-9和VEGF的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的EMT。MEG3過表達(dá)還使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白、Snail蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)下調(diào)來抑制EMT，使胃癌細(xì)胞遷移能力下降，而miR-21的過表達(dá)通過激活EMT促進(jìn)AGS的細(xì)胞遷移。共轉(zhuǎn)染lncRNA-MEG3和miR-21模擬物可拮抗MEG3對細(xì)胞遷移的抑制作用。因此，MEG3/miR-21軸通過抑制胃癌EMT而影響胃癌細(xì)胞的遷移能力。

有關(guān)抑制miR-21表達(dá)的上游調(diào)控分子總結(jié)于表1，然而當(dāng)前研究尚存在一些問題：如實(shí)驗(yàn)中僅僅只關(guān)注了單個或幾個miRNA水平的變化，并未反映整體水平的變化規(guī)律；又如一些miR-21抑制劑靶向特異性不高或存在脫靶問題，從而造成不良后果。但無論如何，研究針對miR-21的新藥物，發(fā)現(xiàn)抑制miR-21的新靶點(diǎn)或新途徑，未來應(yīng)用于胃癌預(yù)防和治療的前景廣闊。

表1 抑制miR-21表達(dá)的上游調(diào)控分子

4 結(jié)語

miR-21分子與胃癌關(guān)系密切，它可通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。miR-21可作為胃癌早期診斷和預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。通過抑制miR-21分子功能而抑制胃癌進(jìn)展的研究取得了一定成果，但存在病例樣本數(shù)過少、體內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)缺乏等問題，使miR-21分子在胃癌病理進(jìn)程中的作用機(jī)制探討稍顯不足，尤其是各個調(diào)控通路的相關(guān)性和級聯(lián)性還未被完全發(fā)掘。相信隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和機(jī)制研究的深入，miR-21分子及其抑制劑應(yīng)用于胃癌早期診斷和治療的春天即將到來。