蔡巖，肖大可，潘欣，滿江紅

國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是人腦最常見、最致命的原發(fā)性腫瘤。腦膠質(zhì)瘤患者平均生存周期僅為12～15個(gè)月[1-2]。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）是位于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞頂層的具有自我更新、多向分化及增殖潛能的一類腫瘤細(xì)胞[3-5]，它們能夠起始腫瘤發(fā)生并且對(duì)放化療不敏感。越來越多的證據(jù)表明腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的決定性因素[6-7]。

人類基因組中大部分RNA不能被翻譯為蛋白質(zhì)，這類RNA被稱為非編碼RNA[8]。一部分非編碼RNA的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，被稱為長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）。其中，基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long intergenic non-coding RNA，LincRNA）是一類處于編碼基因之間的非編碼RNA，通常小于蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄本。LincRNA的表達(dá)量低，但卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的組織特異性[9-11]。部分研究表明LincRNA在表觀遺傳、細(xì)胞周期及分化等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在腦膠質(zhì)瘤中，LincRNA的異常表達(dá)影響著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，對(duì)腦腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用[12-15]。然而，LincRNA在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的功能有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過RNA測(cè)序篩選，比對(duì)了多株不同腦膠質(zhì)瘤患者來源的GSC以及對(duì)應(yīng)的非干性腫瘤細(xì)胞中LncRNA的表達(dá)，篩選出一系列在GSC中特異性高表達(dá)且發(fā)揮重要功能的LncRNA。通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選到的LncRNA進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)Linc8910具有良好的預(yù)后相關(guān)性。本研究通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）干涉技術(shù)在GSC中敲低Linc8910，檢測(cè)其對(duì)GSC的增殖能力及自我更新能力的影響。進(jìn)一步探究了Linc8910在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖中的功能，從LncRNA角度為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人胚胎腎細(xì)胞HEK293T來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；人源GSC細(xì)胞T4121受贈(zèng)于美國(guó)加州大學(xué)Jeremy Rich實(shí)驗(yàn)室，該細(xì)胞株按照本實(shí)驗(yàn)室方案進(jìn)行了篩選及鑒定。

DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA、谷氨酰胺（100×）、青霉素-鏈霉素混合液（100×）、丙酮酸鈉（100 mmol/L）、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑MaxiCaP購(gòu)自中科邁晨（北京）科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自Ex-Cell Bio生物科技有限公司；PowerUp SYBR Green Master Mix、Neuro-basal培養(yǎng)基、B-27血清替代物購(gòu)自Thermo Fisher公司；Accutase購(gòu)自Sigma公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（β-FGF）、重組人表皮生長(zhǎng)因子（rhEGF）購(gòu)自R&D Systems公司；PrimeScript RT Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay購(gòu)自Promega公司；RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司。

Q-PCR儀（LC96）購(gòu)自 Roche公司；PCR儀（GSX1）、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA3111）、熒光成像顯微鏡（EVOSM5000）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Glomax全自動(dòng)熒光檢測(cè)儀（9101-002）購(gòu)自Promega公司；微量分光儀（NanoDrop 2000c）購(gòu)自基因有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

在無菌超凈臺(tái)中配制培養(yǎng)基。

1.2.1 DMEM完全培養(yǎng)基 向500 mL DMEM培養(yǎng)基中加入50 mL胎牛血清和5.5 mL青霉素-鏈霉素混合液，充分混勻后放置4℃冰箱保存。

1.2.2 干細(xì)胞完全培養(yǎng)基 向500 mL Neurobasal培養(yǎng)基中加入青霉素-鏈霉素混合液、丙酮酸鈉和左旋谷氨酰胺各5 mL，加入10 mL B-27血清替代物以及濃度均為20 ng/mL的rhEGF和β-FGF各20 μL，充分混勻后4℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

1.3.1 HEK293T的培養(yǎng)與傳代 用DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞密度過高會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，因此當(dāng)細(xì)胞密度大于85%時(shí)須進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體步驟為：棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基；沿培養(yǎng)皿內(nèi)壁加入無菌PBS，輕輕搖晃培養(yǎng)皿洗凈細(xì)胞代謝物和殘余培養(yǎng)基，棄去PBS；向培養(yǎng)皿中加入1 mL Trypsin-EDTA，于37℃培養(yǎng)箱靜置1 min進(jìn)行消化；向培養(yǎng)皿中加入3 mL DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r/min離心3 min，棄上清；用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種在新的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 GSC的培養(yǎng)與傳代 用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)。GSC在培養(yǎng)過程中會(huì)聚集形成腫瘤細(xì)胞球，腫瘤細(xì)胞球較大時(shí)會(huì)影響細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)狀態(tài)，因此須消化傳代。具體步驟為：將培養(yǎng)皿中的全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r/min離心3 min，棄上清；用無菌PBS重懸細(xì)胞并反復(fù)吹洗，800 r/min離心3 min，棄上清；用1 mL Accutase胰酶重懸細(xì)胞，消化3 min；加入5 mL無菌PBS稀釋胰酶和細(xì)胞的混懸液，800 r/min離心3 min，棄上清；用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 血清誘導(dǎo)GSC分化

將GSC消化成單個(gè)細(xì)胞后，離心去上清，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，充分混勻后接種于培養(yǎng)皿中。由于DMEM完全培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清，可以誘導(dǎo)GSC向非干性腫瘤細(xì)胞（non-stem tumor cell，NSTC）分化。GSC完全分化為NSTC的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為SOX2和Olig2蛋白（GSC相關(guān)蛋白標(biāo)志物）逐漸減少至消失，同時(shí)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，NSTC蛋白標(biāo)志物）表達(dá)明顯增加，在細(xì)胞形態(tài)上可以看到細(xì)胞處于貼壁狀態(tài)，無法形成腫瘤球。按照此方法分化GSC，約7 d分化為NSTC。

1.5 慢病毒包裝及感染細(xì)胞

將3×106HEK293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至30%～40%時(shí)采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行病毒包裝。向1.5 mL EP管中加入包裝質(zhì)粒psPAX2和pCMV-VSVG各5 μg，目的質(zhì)粒（pLKO-shNT、pLKO-sh8910#1、pLKO-sh8910#2和pLKO-sh8910#3）各 5 μg，用 1 mL HBS 混勻，靜置5 min；滴入 70 μL CaCl2溶液，混勻后靜置 15 min；將轉(zhuǎn)染體系滴加到提前接種的HEK293T細(xì)胞中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使液體混勻，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，72 h后將培養(yǎng)基上清收集至50 mL離心管中，3500 r/min離心15 min，用0.45 μm孔徑的濾器過濾到新的離心管中，向過濾后的病毒液體中加入病毒濃縮液（5×PEG），顛倒混勻，4℃靜置過夜；將病毒液體于4℃、7000 r/min離心15 min，吸去上清，用1 mL冰PBS重懸病毒沉淀，混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心15 min，取上清分裝到600 μL無菌EP管中，每管分裝200 μL，-80℃保存。

將GSC消化處理成單個(gè)細(xì)胞，取1.5×106GSC用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入200 μL病毒后充分混勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每2 d傳代一次。

1.6 在mRNA水平檢測(cè)Linc8910的表達(dá)

收取1×106分化前的GSC及分化后的NSTC，用RNeasy Mini Kit提取RNA。加入350 μL Buffer RLT重懸細(xì)胞并充分裂解；加入350 mL無RNA酶的70%乙醇混勻，立即轉(zhuǎn)入結(jié)合柱；室溫靜置2 min，10 000 r/min離心30 s，棄下層液體；向結(jié)合柱中加入 700 μL RW Wash Buffer，4℃、10 000 r/min離心30 s，棄下層液體；加入500 μL RPE Buffer，4℃、10 000 r/min離心30 s，棄下層液體，重復(fù)此步驟2次；將結(jié)合柱放入新的無RNA酶的EP管中，每管加入40 μL無RNA酶水，靜置2 min；室溫10 000 r/min離心2 min洗脫，用NanoDrop 2000c測(cè)量濃度。

將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。向PCR管中加入 2 μL 提取的 RNA 樣品和 2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，最后加入6 μL無RNA酶水補(bǔ)齊總體系至10 μL，在PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，程序?yàn)?7℃ 15 min、85℃ 15 s。在Q-PCR引物設(shè)計(jì)相關(guān)網(wǎng)站（Primer Bank）查找適合Linc8910的QPCR引物，由北京博邁德基因科技有限公司合成。10 μL Q-PCR反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄的Linc8910的cDNA模板3 μL、上游和下游引物各0.25 μL、SYBR Green Master Mix 5 μL、ddH2O 1.5 μL。將體系加到96孔板中，于Q-PCR儀中按設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 細(xì)胞活力測(cè)定及腫瘤細(xì)胞球形成能力

將感染病毒后的GSC消化處理成單個(gè)細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目。將敲低組和對(duì)照組分別接種到96孔板，每孔2×103細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，采用CellTiter-Glo試劑盒分別檢測(cè)第0、2、4 d的細(xì)胞活力。每孔加入100 μL CellTiter-Glo試劑，混勻后取200 μL加到可避光的黑色96孔板中，水平搖床孵育10 min，用Glomax全自動(dòng)熒光儀檢測(cè)細(xì)胞活力。觀察第6 d孔板里的腫瘤球數(shù)目和形態(tài)，用成像顯微鏡拍攝。

1.8 數(shù)據(jù)來源與分析

Linc8910信息源自UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)（http://genome.ucsc.edu/）。所有數(shù)據(jù)分析均使用GraphPad Prism 8.02軟件。將T4121 GSC分化前后以及敲低Linc8910后檢測(cè)得到的mRNA水平數(shù)據(jù)按分組整理，填入GraphPad Prism 8.02軟件的表格中繪制生成圖表，圖3A組間差異分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Linc8910基本信息

UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)研分析表明，Linc8910的名稱為PCOLCE-AS1，位于第7號(hào)染色體上，全長(zhǎng)2550 bp（圖1）。

圖1 Linc8910基本信息（UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)）

2.2 Linc8910在GSC中特異性高表達(dá)

選取T4121 GSC及其分化第6 d的NSTC，分別收取細(xì)胞樣品，裂解后提取RNA。用2對(duì)不同的引物（Primer1和Primer2）對(duì)Linc8910的表達(dá)進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，用干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Olig2和Sox2的表達(dá)水平指示GSC分化情況。結(jié)果顯示，GSC在血清誘導(dǎo)分化第6 d時(shí)其干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯降低，表明GSC分化。Linc8910在T4121 GSC中的mRNA水平明顯高于其分化后的NSTC（圖2）。以上結(jié)果表明Linc8910在T4121 GSC中高表達(dá)，而在T4121 NSTC中低表達(dá)。

圖2 Linc8910在T4121 GSC和分化后的NSTC中的mRNA表達(dá)水平（x±s，n=3）

2.3 敲低Linc8910對(duì)GSC生長(zhǎng)的影響

為了敲低Linc8910在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，我們構(gòu)建了靶向Linc8910不同序列的shRNA干涉質(zhì)粒sh8910#1、sh8910#2、sh8910#3及對(duì)照干涉質(zhì)粒shNT，并進(jìn)行慢病毒包裝。慢病毒感染T4121 GSC后72 h收取細(xì)胞樣品，提取RNA后進(jìn)行QPCR分析，對(duì)Linc8910的敲低效果進(jìn)行檢測(cè)（圖3A）。同時(shí)，我們將感染病毒后的GSC消化成單個(gè)細(xì)胞，將敲低組和對(duì)照組細(xì)胞分別接種96孔板，用Cell Titer-Glo試劑盒測(cè)定第0、2、4 d的細(xì)胞活力（圖3B）。此外，我們將病毒感染后的GSC接種于96孔板，觀察細(xì)胞形成腫瘤球的情況，并用成像顯微鏡拍攝GSC形成腫瘤球的形態(tài)（圖3C）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向Linc8910的3條不同的shRNA干涉序列均具有良好的敲低效果。細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果顯示Linc8910敲低組的細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組，表明敲低Linc8910能夠明顯抑制GSC的增殖能力。腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Linc8910敲低組的腫瘤細(xì)胞球數(shù)量明顯少于對(duì)照組，表明敲低Linc8910能夠顯著抑制GSC的自我更新能力。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，它的發(fā)生發(fā)展與多種因素密切相關(guān)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是腦腫瘤中惡性程度最高的原發(fā)性實(shí)體瘤。GBM具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)性，與正常腦組織無明顯邊界，導(dǎo)致難以完全切除[16-17]。目前，臨床上主要的治療手段為手術(shù)切除聯(lián)合藥物治療及放射治療等，但治療效果不理想。研究表明，GSC在GBM的發(fā)生、維持、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[18-19]。因此，將GSC作為研究對(duì)象并探究其調(diào)控機(jī)制，對(duì)GBM的發(fā)生和治療具有重要意義。

目前，對(duì)于LncRNA在GSC中的功能研究較少。部分研究表明，腦膠質(zhì)瘤中LncRNA的異常表達(dá)可能影響GSC的生長(zhǎng)與分化，對(duì)腦腫瘤發(fā)生有重要影響[13,20]。基于本實(shí)驗(yàn)室的GSC研究體系，我們從LncRNA角度探究其對(duì)GSC的調(diào)控機(jī)制。我們通過RNA測(cè)序篩選技術(shù)鑒定到Linc8910在GSC中特異性高表達(dá)，且表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的NSTC。為了了解Linc8910在GSC中的功能，通過shRNA干涉技術(shù)在GSC中敲低Linc8910，發(fā)現(xiàn)敲低Linc8910表達(dá)能夠顯著抑制GSC的腫瘤細(xì)胞球形成能力及細(xì)胞活力，提示Linc8910對(duì)GSC的增殖及腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展可能具有重要的調(diào)控功能。我們將進(jìn)一步探究Linc8910在GSC中的作用機(jī)制，為腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)和策略。