王 爽 程玉祥 夏德安

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

根毛是由植株根系表皮的單細(xì)胞向外凸起形成的管狀結(jié)構(gòu)，是植物營(yíng)養(yǎng)吸收的主要器官[1]。根毛發(fā)育是細(xì)胞極性生長(zhǎng)的一種極端類型——頂端生長(zhǎng)，可在十幾小時(shí)內(nèi)向特定方向生長(zhǎng)十幾倍的細(xì)胞長(zhǎng)度[2～3]。這種頂端生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受到活性氧，鈣離子濃度，磷脂肌醇，囊泡運(yùn)輸，細(xì)胞骨架等諸多因素的精細(xì)調(diào)控[4～7]。例如，活性氧的產(chǎn)生與定位能決定植物細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生，活性氧含量的增加可改變細(xì)胞壁的剛性，促進(jìn)了根毛的頂端生長(zhǎng)[8～9]；上游信號(hào)激活根毛頂端質(zhì)膜上的鈣離子通道，調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，使胞內(nèi)鈣離子濃度增加，形成鈣離子濃度梯度，從而調(diào)控根毛頂端生長(zhǎng)[10～11]。

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)催化甘油磷酸二酯水解成甘油-3-磷酸和相應(yīng)的醇類，在原核生物和真核生物的各種生理過(guò)程中起著重要作用[12]。擬南芥GDPD基因家族可分為GDPD和GDPD-Like(GDPDL)兩個(gè)亞族。AtGDPDL基因家族包括7個(gè)成員(AtGDPDL1-7)，與傳統(tǒng)的擬南芥GDPD不同，擬南芥GDPDL包含兩個(gè)非典型GDPD結(jié)構(gòu)域[13]。此外，研究顯示AtGDPD-Like3基因在擬南芥的根毛組織中高豐度表達(dá)，其次是葉柄，下胚軸和幼葉。該基因的表達(dá)與擬南芥的根毛形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)，是根毛伸長(zhǎng)所必須的。在AtGDPD-Like3和AtGDPD-Like1雙突變體shv3svl1中，細(xì)胞壁分析顯示結(jié)晶纖維素含量減少致使細(xì)胞壁組分發(fā)生改變，導(dǎo)致嚴(yán)重的根毛細(xì)胞發(fā)育缺陷[14～15]。然而，影響AtGDPD-Like3蛋白功能行使的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)尚不清楚。

在本研究中，對(duì)AtGDPD-Like3保守的氨基酸列序位點(diǎn)分析，推測(cè)出Leu521、Ser538、Leu544、Val556、Glu621、Asp628可能是AtGDPD-Like3蛋白行使功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。進(jìn)一步我們創(chuàng)制AtGDPD-Like3的Ser538、Val556、Asp628單點(diǎn)突變型，基于遺傳轉(zhuǎn)化策略驗(yàn)證其能否恢復(fù)atgapdl3突變體根毛缺陷表型，篩選AtGDPD-Like3蛋白質(zhì)的功能關(guān)鍵位點(diǎn)，為進(jìn)一步探究AtGDPD-Like3蛋白功能行使的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物總RNA提取試劑pBIOZOL Reagent購(gòu)自Bioflux公司，植物基因組DNA快速提取試劑購(gòu)自Bioteke公司，pMD18-T載體、cDNA第一鏈合成試劑PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser和MutanBEST Kit試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。高保真DNA聚合酶KOD-Plus購(gòu)自Toyobo公司,膠內(nèi)DNA回收試劑盒Silica Bead DNA Gel Extrction Kit購(gòu)自Thermo Scientific。pGWB2載體購(gòu)自Invitrogen公司，基因引物合成以及DNA測(cè)序也由Invitrogen公司完成。anti-FLAG鼠單克隆抗體購(gòu)自AbMART公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1AtGDPD-Like3氨基酸序列分析

AtGDPD-Like3基因信息從擬南芥TAIR10數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取(https://www.arabidopsis.org/)，NCBI-BLAST檢索、獲取其同源基因推測(cè)氨基酸序列，用BioEdit比對(duì)分析保守氨基酸序列。

1.2.2 植物總RNA、基因組DNA提取和cDNA第一鏈合成

植物總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成參照試劑盒的提取步驟依次進(jìn)行。用一步法植物基因組DNA快速提取試劑提取植物基因組DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和氨基酸位點(diǎn)突變

PCR擴(kuò)增體系20 μL：13.5 μL ddH2O，2 μL dNTPs(2 mmol·L-1)，2 μL 10×Taq Buffer，上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，引物退火溫度56℃，延伸30 s。T-DNA鑒定和ACTIN2基因擴(kuò)增分別為30和25個(gè)循環(huán)。氨基酸位點(diǎn)突變的制備參見(jiàn)MutanBEST Kit所提供的方法。

1.2.4 T-DNA插入基因突變體鑒定

“老年癡呆癥”難聽(tīng)，“阿爾茨海默病”難記。一個(gè)病名引發(fā)的討論，有助于加強(qiáng)公眾對(duì)它的認(rèn)知，減少對(duì)它的歧視。在中國(guó)，由于老齡化加劇和醫(yī)保體系尚未完善，阿爾茨海默病的防治將面對(duì)更為復(fù)雜的困境

提取待鑒定的植株基因組DNA作模板，使用SALK_137845-LP和SALK_137845-RP、SALK_137845-LP和LBb1、LBb1和SALK_137845-RP三對(duì)引物進(jìn)行交叉PCR擴(kuò)增，對(duì)T-DNA插入突變體進(jìn)行鑒定；從瓊脂糖膠上回收擴(kuò)增的DNA片段，連接pMD18-T載體，對(duì)插入片段克隆測(cè)序。試驗(yàn)中所用引物及序列參見(jiàn)表1。

1.2.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

植物表達(dá)載體的構(gòu)建采用Gateway系統(tǒng)[16]。擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化采用浸花法[17]，選用達(dá)到8周齡擬南芥用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.6 蛋白質(zhì)Western印跡分析

擬南芥轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)FLAG-融合蛋白質(zhì)水平檢測(cè)采用Western免疫印跡法[18]。提取植物組織蛋白質(zhì)用于SDS-APGE，將SDS-膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脫脂奶粉TBST 4℃封閉過(guò)夜。然后加入1∶2 000稀釋的anti-FLAG鼠單克隆抗體于室溫下孵育1 h 30 min；TBST洗膜3次后，加入1∶2 500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗于室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色。

表1 所用引物及序列

1.2.7 擬南芥根毛形態(tài)觀察及量化統(tǒng)計(jì)

對(duì)1/2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天的擬南芥幼苗，用體式顯微鏡觀察其根毛表型。根毛長(zhǎng)度和密度的統(tǒng)計(jì)均取來(lái)胚軸與根交界處自上而下4 mm區(qū)間的所有根毛。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用使用SPASS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtGDPD-Like3單突變位點(diǎn)選擇

鑒定AtGDPD-Like3基因T-DNA插入突變體時(shí)，以SALK_137845植株基因組DNA為模板，用引物SALK_137845-LP和SALK_137854-RP未擴(kuò)增出目標(biāo)帶，而SALK_137845-RP和LBb1擴(kuò)增出目標(biāo)帶，兩者表明T-DNA插入在該基因區(qū)域，DNA測(cè)序顯示插入位點(diǎn)在At4g26690第7個(gè)外顯子260 bp處。RT-PCR分析顯示未檢測(cè)到AtGDPD-Like3基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此SALK_137845是AtGDPD-Like3基因敲除突變體。

AtGDPD-Like3編碼759個(gè)氨基酸，含有GDPD-Like結(jié)構(gòu)域。選用大豆，毛果楊，油菜，甘藍(lán)，高粱，玉米等22個(gè)物種的AtGDPD-Like3同源基因，推測(cè)氨基酸序列一致性比對(duì)顯示Leu521、Ser538、Leu544、Val556、Glu621、Asp628是保守氨基酸位點(diǎn)(圖1)，這些氨基酸位點(diǎn)可能是GDPD-Like結(jié)構(gòu)域功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。基于此，我們選取其中的3個(gè)保守位點(diǎn)Ser538、Val556、Asp628作為突變的目標(biāo)，驗(yàn)證其位點(diǎn)的分子功能。

圖1 AtGDPD-Like3及其同源蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Amino acid sequence alignment of AtGDPD-Like3 and its homologous proteins

圖2 AtGDPD-Like3單點(diǎn)S538A、V556A和D628A突變的載體構(gòu)建 M.Marker；a. 1～3，F(xiàn)LAG-tag+N端信號(hào)肽片段；FLAG-tag+AtGDPD-Like3(去除信號(hào)肽部分)；FLAG-AtGDPDL3；b. 4，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3；c. 5～7，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A線性片段；d. 8～10，pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 Construction of vectors of single site mutations S538A, V556A and D628A in AtGDPD-Like3, respectively a.1-3, N-terminal signal peptides plus FLAG fragment,FLAG-AtGDPDL3 without signal peptides and FLAG-AtGDPDL3; b. 4, pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3; c. pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628 A fragments; d. 8-10,PCR determination of pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628 A plasmids

圖3 FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3轉(zhuǎn)基因分子鑒定 a.轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄水平鑒定；b.轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)含量鑒定，ACTIN蛋白質(zhì)量作為定量?jī)?nèi)標(biāo)蛋白；WT.野生型擬南芥；L1-4、L5-8、L9-11和L12-15，分別為FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3轉(zhuǎn)基因植株Fig.3 Molecular identification of the transgenes of FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3 a.Detection of transgenic plants on the transcriptional level; b.Determination of transgenic plants on the protein level using the ACTIN protein as a control; WT. Wild-type Arabidopsis; L1-4,L5-8,L9-11 and L12-15 indicate the FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A,-D628A and FLAG-AtGDPDL3 transgenic plants,respectively

2.2 S538A、V556A和D628A單位點(diǎn)突變的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)采用重疊PCR策略，將FLAG標(biāo)簽短肽融合在AtGDPD-Like3信號(hào)肽之后。以擬南芥cDNA為模板，分別用CDS-up/mR和mF/CDS-down兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物(圖2a:泳道1～2)混合作為模板，再用AtGDPD-Like3基因CDS-up/down引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到FLAG-AtGDPDL3片段(圖2:泳道3)。將之連接到pENTR/SD/D-TOPO載體上(圖2b)，測(cè)序表明FLAG短肽序列融合在AtGDPD-Like3信號(hào)肽和GDPD-Like結(jié)構(gòu)域之間。

以pENTR/SD/D-FLAG-AtGDPDL3質(zhì)粒為模板，分別用3對(duì)單點(diǎn)突變引物S538A-up/down、V556A-up/down和D628A-up/down進(jìn)行擴(kuò)增，得到S538A、V556A和D628A單點(diǎn)突變FLAG-AtGDPDL3線性片段(圖2c)。經(jīng)末端磷酸化處理后自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化TOPO10。對(duì)菌落進(jìn)行PCR鑒定，得到的片段與目標(biāo)片段大小相符(圖2d)，測(cè)序結(jié)果顯示除指定位點(diǎn)突變外無(wú)其它位點(diǎn)堿基突變。用LR重組反應(yīng)將pENTR/SD/D-TOPO載體上這4種FLAG-AtGDPDL3片段重組到pGWB2植物表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，用于擬南芥atgdpdl3突變體功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。

圖4 AtGDPD-Like3的Ser538、Val556、Asp628位點(diǎn)對(duì)根毛表型的作用 a.WT；atgdpdl3突變體；FLAG-AtGDPDL3；FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A轉(zhuǎn)基因植株根毛圖；b.統(tǒng)計(jì)分析各植株根毛平均長(zhǎng)度；c.統(tǒng)計(jì)分析各植株根毛平均密度Fig.4 Roles of Ser538,Val556 or Asp628 of AtGDPD-Like3 in root hair phenotypes a.Root hair photos of WT,atgdpdl3 mutants,FLAG-AtGDPDL3 and FLAG-AtGDPDL3-S538A,-V556A and -D628A transgenic plants; b.Statistical analysis of root hair length in WT and transgenic plants; c.Statistical analysis of root hair density in WT and transgenic plants

2.3 點(diǎn)突變的AtGDPD-Like3轉(zhuǎn)化atgdpdl3突變體

用浸花法對(duì)atgdpdl3突變體植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，獲得轉(zhuǎn)FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A、FLAG-AtGDPDL3抗性植株4、4、3和4株系。以轉(zhuǎn)基因植株cDNA為模板，用引物AtGDPDL3-RT-up/down進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果顯示FLAG-AtGDPDL3基因及其S538A、V556A和D628A單點(diǎn)突變形，在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)錄水平均較高(圖3a)。用FLAG抗體對(duì)轉(zhuǎn)錄水平高的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果顯示FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3表達(dá)量均較高(圖3b)。這表明FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A、-D628A和FLAG-AtGDPDL3在atgdpdl3突變體植株中均正常表達(dá)，這些材料用于接下來(lái)的根毛表型分析。

2.4 單點(diǎn)突變AtGDPD-Like3對(duì)atgdpdl3根毛缺陷表型恢復(fù)程度分析

在培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)7天后顯微觀察根毛生長(zhǎng)情況顯示(圖4a)，T-DNA插入突變體atgdpdl3幾乎不長(zhǎng)根毛，表現(xiàn)根毛缺陷；FLAG-AtGDPDL3轉(zhuǎn)入atgdpdl3突變體，能夠完全恢復(fù)根毛缺陷表型；轉(zhuǎn)入FLAG-AtGDPDL3-S538A、-V556A和-D628A對(duì)根毛缺陷恢復(fù)效果之間明顯不同，S538A突變FLAG-AtGDPDL3是部分程度地恢復(fù)根毛缺陷，而V556A和D628A突變FLAG-AtGDPDL3卻完全恢復(fù)根毛缺陷表型。

為了準(zhǔn)確地顯示這些遺傳材料根毛表型的差異，對(duì)胚軸與根交界處起自上而下4 mm區(qū)間所有根毛長(zhǎng)度和密度進(jìn)行了量化統(tǒng)計(jì)(圖4:b～c)。FLAG-AtGDPDL3、FLAG-AtGDPDL3-V556A、FLAG-AtGDPDL3-D628A轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，根毛長(zhǎng)度和密度幾乎一致。沒(méi)有明顯差異；而FLAG-AtGDPDL3-S538A轉(zhuǎn)基因植株根毛平均長(zhǎng)度減少了25%，根毛平均密度減少了46%。這表明V556A、D628A位點(diǎn)突變不影響AtGDPD-Like3恢復(fù)atgdpdl3根毛缺陷表型，換言之Val556、Asp628位點(diǎn)不是AtGDPD-Like3蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點(diǎn)。相反，S538A突變AtGDPD-Like3只是部分恢復(fù)atgdpdl3突變體根毛缺陷表型，表明Ser538位點(diǎn)是AtGDPD-Like3一個(gè)較為關(guān)鍵的位點(diǎn)。

3 討論

根毛是植物重要器官之一，負(fù)責(zé)植物從土壤中吸收水份和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[19]。Jones等[20]采用突變體策略鑒定出多個(gè)參與擬南芥根毛發(fā)育的重要基因，其中RHM4是本研究的AtGDPD-Like3基因。在這里我們鑒定AtGDPD-Like3一個(gè)新的T-DNA插入突變體(SALK_137845)，該突變體atgdpdl3根毛生長(zhǎng)嚴(yán)重缺陷，與rhm4突變體表型一樣，實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)入FLAG-AtGDPDL3完全恢復(fù)atgdpdl3根毛缺陷，顯示該基因?qū)M南芥根毛發(fā)育的功能。

在鑒定AtGDPD-Like3關(guān)鍵位點(diǎn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)采用融合標(biāo)簽短肽FLAG策略。FLAG短肽含8個(gè)氨基酸，通常不影響目標(biāo)蛋白質(zhì)正常結(jié)構(gòu)和功能，卻方便用其肽抗體(anti-FLAG)分析目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量。AtGDPD-Like3的N端含有信號(hào)肽，C端存在GPI錨[9]。為了不破壞GPI錨，確保FLAG-AtGDPDL3細(xì)胞內(nèi)正確定位，實(shí)驗(yàn)把FLAG短肽融合在AtGDPD-Like3的N端信號(hào)肽之后。

用能否恢復(fù)atgdpdl3根毛缺陷策略，實(shí)驗(yàn)鑒定AtGDPD-Like3保守氨基酸位點(diǎn)Ser538、Val556和Asp628對(duì)根毛缺陷恢復(fù)效果。其中Ser538突變的AtGDPD-Like3只能部分恢復(fù)根毛缺陷，表明該位點(diǎn)是AtGDPD-Like3關(guān)鍵位點(diǎn)。它位點(diǎn)GDPD-Like結(jié)構(gòu)域上，很可能是該酶活性依賴的重要位點(diǎn)。今后可以分析Ser538突變的AtGDPD-Like3酶學(xué)相關(guān)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，了解它是如果影響AtGDPD-Like3的。

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明AtGDPD-Like3存在其它的關(guān)鍵位點(diǎn)。由于AtGDPD-Like3包含兩個(gè)GDPD-Like結(jié)構(gòu)域[8]，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能是否冗余還不清楚。本實(shí)驗(yàn)的Ser538突變位于第二個(gè)GDPD-Like結(jié)構(gòu)域，第一個(gè)GDPD-Like結(jié)構(gòu)域也可能行使作用。在本研究中只鑒定AtGDPD-Like3保守的3個(gè)單位點(diǎn)的作用，對(duì)于其他位點(diǎn)是否影響AtGDPD-Like3功能沒(méi)有涉及。今后我們將采用雙位點(diǎn)或多位點(diǎn)同時(shí)突變策略，來(lái)確定它們對(duì)AtGDPD-Like3行使功能的作用。