雷妍圓，呂利華*，王裕華，王德森

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda，屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一種原產(chǎn)于美洲的農(nóng)作物害蟲(chóng)，具有寄主植物廣、繁殖能力強(qiáng)、遷飛擴(kuò)散快和為害嚴(yán)重等特點(diǎn)，已在美洲、非洲及亞洲對(duì)玉米生產(chǎn)造成了巨大損失(Casmuzeetal., 2010; Earlyetal., 2018; 姜玉英等，2019)。2019年1月首次在我國(guó)云南省發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)草地貪夜蛾入侵，至目前已在全國(guó)21個(gè)省份蔓延，危害程度逐日增加(姜玉英等，2019；王磊等，2019；楊普云等，2019)。入侵我國(guó)的草地貪夜蛾已確認(rèn)為玉米品系(張磊等，2019)，主要在幼蟲(chóng)期取食為害。幼蟲(chóng)共有6齡，取食玉米葉片、穗軸、籽粒和鉆蛀根基部，影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。廣東地處亞熱帶，氣候適宜且常年種植玉米，為草地貪夜蛾越冬提供了優(yōu)越的寄主條件，是草地貪夜蛾的周年繁殖區(qū)，防控任務(wù)艱巨(郭井菲等，2018；廖永林等，2019)。根據(jù)“長(zhǎng)短結(jié)合、標(biāo)本兼治”的防治原則(楊普云等，2019)，昆蟲(chóng)病原真菌作為生物防治的一個(gè)重要組成部分，在持續(xù)控制蟲(chóng)害、保護(hù)生態(tài)平衡方面具有不可替代的作用(Shah and Pell, 2003; 張禮生和陳紅印, 2014)。篩選對(duì)草地貪夜蛾高特異性和高效率的生防病原真菌，是我國(guó)草地貪夜蛾可持續(xù)防控工作的重要任務(wù)。

據(jù)報(bào)道，白僵菌Beauveriaspp.和綠僵菌Metarhiziumanisopliae對(duì)草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲(chóng)有一定的防治效果(Lezama Gutiérrezetal., 2001; Garcíaetal., 2011; Thomazonietal., 2014)。在利用玫煙色蟲(chóng)草Cordycepsfumosorosea[原玫煙色棒束孢Isariafumosorosea(Kepleretal., 2017) ]防治草地貪夜蛾方面，除了個(gè)別研究提到可用于防治低齡幼蟲(chóng)(Lezama Gutiérrezetal., 1996)，其余未見(jiàn)相關(guān)研究和報(bào)道。玫煙色蟲(chóng)草作為一類國(guó)際上研究和應(yīng)用較為廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，能寄生同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等多種有害昆蟲(chóng)(Meyeretal., 2008; 雷妍圓等, 2011; Huetal., 2011; Asietal., 2013)。本研究室曾報(bào)道一株高致病力的玫煙色蟲(chóng)草SCAU-IFCF01(呂利華等, 2007)，其對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)小菜蛾P(guān)lutellaxylostlla2齡幼蟲(chóng)的LT50僅1.72 d，LC50為1.17×104孢子/mL，表現(xiàn)出對(duì)該類害蟲(chóng)巨大的防控應(yīng)用潛力。本文研究了該菌株對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的侵染過(guò)程及致病力，以明確該菌株對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致病性、防治時(shí)期和防治劑量濃度等參數(shù)，為評(píng)價(jià)玫煙色蟲(chóng)草對(duì)草地貪夜蛾的防治潛力，研發(fā)相關(guān)高效生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源和菌株

草地貪夜蛾幼蟲(chóng)采集于廣東省廣州市白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地“粵甜28”甜玉米(ZeamaysL.)植株上，在實(shí)驗(yàn)室用玉米葉和果穗飼養(yǎng)至化蛹，待其羽化產(chǎn)卵后建立實(shí)驗(yàn)室種群作為供試蟲(chóng)源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為26℃±1℃，相對(duì)濕度60%～90%，光照條件14 L ∶10 D。玫煙色蟲(chóng)草菌株SCAU-IFCF01(雷妍圓等，2010)接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 L)平板上，27℃全黑暗條件下培養(yǎng)20 d待用。

1.2 玫煙色蟲(chóng)草對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)侵染癥狀觀察

從SDAY平板上收集玫煙色蟲(chóng)草IFCF01分生孢子，以滅菌0.05%吐溫-80溶液配制1×109孢子/mL濃度孢子懸浮液，分別接種草地貪夜蛾1～6齡幼蟲(chóng)，每個(gè)齡期接種10頭，接種后每天觀察幼蟲(chóng)存活情況及感染病蟲(chóng)的外部特征，分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時(shí)依次取樣。將死亡幼蟲(chóng)保濕培養(yǎng)，24 h后檢查，蟲(chóng)體表面長(zhǎng)出白色菌絲或淺玫煙色分生孢子的視為玫煙色蟲(chóng)草感染致死。

1.3 玫煙色蟲(chóng)草對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致病力測(cè)定

采用浸蟲(chóng)法處理草地貪夜蛾幼蟲(chóng)，以滅菌0.05%吐溫-80溶液分別配制5個(gè)濃度梯度的孢子懸浮液(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109孢子/mL)，每個(gè)濃度為一個(gè)處理，以滅菌0.05%吐溫-80溶液為對(duì)照。分別選擇個(gè)體大小、活力一致的1～6齡幼蟲(chóng)，放入供試孢子濃度的懸浮液中，浸漬10 s后挑出，置于濾紙上吸去多余水分，移至皿底墊有濕潤(rùn)濾紙片的培養(yǎng)皿(d=9 cm)中，皿內(nèi)放入新鮮玉米葉和果穗供其取食，置于人工智能箱中飼養(yǎng)(26±1℃，RH 90%±5%，14 L ∶10 D)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理10頭幼蟲(chóng)。持續(xù)觀察5 d，每天記錄幼蟲(chóng)的死亡數(shù)量，對(duì)死亡幼蟲(chóng)進(jìn)行保濕培養(yǎng)，確定死亡原因。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計(jì)各處理幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率。采用Probit方法計(jì)算致死中時(shí)(LT50)，求回歸方程及計(jì)算致死中濃度(LC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染玫煙色蟲(chóng)草的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)癥狀

草地貪夜蛾1～6齡幼蟲(chóng)均可被IFCF01感染(圖1 A-F)。接種后第5天，各齡期幼蟲(chóng)出現(xiàn)玫煙色蟲(chóng)草感染致死個(gè)體。感菌的低齡幼蟲(chóng)(1～3齡)體表覆蓋菌絲和分生孢子，分生孢子呈淺玫煙色。感菌高齡幼蟲(chóng)(4～6齡)死亡時(shí)間相對(duì)低齡較晚，蟲(chóng)體表面被白色菌絲包裹。

以4齡幼蟲(chóng)為例，在感菌初期，幼蟲(chóng)取食行為、蟲(chóng)體外部形態(tài)與健康幼蟲(chóng)無(wú)差別(圖2 A)。接種48 h，幼蟲(chóng)取食明顯減少或停止取食，部分幼蟲(chóng)瀕死，蟲(chóng)體呈油浸狀，出現(xiàn)強(qiáng)直癥狀，體色出現(xiàn)不均勻改變，對(duì)觸碰反應(yīng)遲鈍。幼蟲(chóng)腹末、胸足基部、腹側(cè)體壁等區(qū)域出現(xiàn)菌絲，表明這些部位最易受到菌體侵染(圖2 B)。接種72 h，感菌幼蟲(chóng)死亡，蟲(chóng)體略縮短萎縮，除頭殼區(qū)域外，幼蟲(chóng)大部分體表布滿菌絲(圖2 C)。接種96 h，幼蟲(chóng)的頭部、胸部和腹部均被濃密的白色菌絲所覆蓋(圖2 D)。接種120 h，幼蟲(chóng)體表的菌絲產(chǎn)孢，蟲(chóng)體被玫煙色分生孢子覆蓋(圖2 E)。

2.2 玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致病力

用5個(gè)濃度玫煙色蟲(chóng)草IFCF01孢子懸浮液處理草地貪夜蛾1～6齡幼蟲(chóng)后，隨著孢子濃度增加和時(shí)間推移，幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率逐漸升高(圖3)。用1×105孢子/mL 濃度處理幼蟲(chóng)，5 d后1～6齡幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率分別為66.7%、54.5%、47.8%、36.7%、22.2%和2.23%。隨著濃度的升高，該菌株對(duì)各齡幼蟲(chóng)的致死率逐漸升高。當(dāng)孢子濃度為1×109孢子/mL時(shí)，1～3齡幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率均達(dá)100%，4齡和5齡幼蟲(chóng)也達(dá)98.9%和50.0%，6齡幼蟲(chóng)達(dá)21.1%。當(dāng)孢子濃度為1×105和1×106孢子/mL時(shí)，4齡、5齡和6齡幼蟲(chóng)死亡率均低于50%，當(dāng)濃度增加到1×107和1×108孢子/mL時(shí)，5齡和6齡幼蟲(chóng)死亡率低于50%，再增加到1×109孢子/mL，6齡幼蟲(chóng)的也低于50%。

應(yīng)用Probit模型，計(jì)算玫煙色蟲(chóng)草IFCF01處理的草地貪夜蛾1齡至5齡幼蟲(chóng)LC50值(表1)，其分別為3.74×104、1.17×105、1.86×105、8.09×105和3.03×108孢子/mL。結(jié)果表明致死率50%的濃度，1齡幼蟲(chóng)最低，104孢子/mL，2～4齡均為105，對(duì)5齡幼蟲(chóng)的LC50最高，108孢子/mL。上述結(jié)果表明，草地貪夜蛾低齡(1～3齡)和4齡幼蟲(chóng)對(duì)該菌株較敏感，5齡幼蟲(chóng)其次，6齡幼蟲(chóng)最難受到侵染并致死。

圖1 草地貪夜蛾各齡期幼蟲(chóng)感染玫煙色蟲(chóng)草IFCF01的外部癥狀(第5天)Fig.1 The external symptoms of Spodoptera frugiperda larvae infected by Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 on the 5th day注：A，1齡；B，2齡；C，3齡；D，4齡；E，5齡；F，6齡。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

圖2 感染玫煙色蟲(chóng)草IFCF01的草地貪夜蛾4齡幼蟲(chóng)癥狀Fig.2 The symptoms of 4th instar larvae of Spodoptera frugiperda at the different stage after infection treatment注：A，接種后24 h；B，接種后48 h；C，接種后72 h；D，接種96 h；E，接種后120 h。Note: A, 24 h after inoculation; B, 48 h after inoculation; C, 72 h after inoculation; D, 96 h after inoculation; E, 120 h after inoculation.

圖3 玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致病力Fig.3 The pathogenicity of Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 against Spodoptera frugiperda larvae注：A，1齡；B，2齡；C，3齡；D，4齡；E，5齡；F，6齡。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

表1 玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致病力回歸方程

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的最終死亡率低于50%，無(wú)法估算LC50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-” represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LC50values cannot be estimated.

2.3 玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致死時(shí)間效應(yīng)

隨玫煙色蟲(chóng)草IFCF01孢子懸浮液濃度的增加，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致死中時(shí)(LT50)縮短(表2)。孢子濃度越高，幼蟲(chóng)的LT50值越小，在1.0×105～1.0×109孢子/mL范圍內(nèi)，1齡幼蟲(chóng)LT50從3.62 d降至1.37 d，對(duì)2齡幼蟲(chóng)的LT50從4.51 d降至1.65 d；在濃度為1.0×106～1.0×109孢子/mL的范圍內(nèi)，對(duì)3齡幼蟲(chóng)的LT50從4.03 d降至1.82 d；在濃度為1.0×107～1.0×109孢子/mL范圍內(nèi)，對(duì)4齡幼蟲(chóng)的LT50從3.47 d降至2.52 d；濃度為1.0×109孢子/mL時(shí)，5齡幼蟲(chóng)的LT50為4.74 d。當(dāng)濃度為1.0×105和1.0×109孢子/mL時(shí)，3齡和6齡幼蟲(chóng)的最終死亡率分別為47.8%和21.1%，均低于50%；1.0×105和1.0×106孢子/mL時(shí)，4齡幼蟲(chóng)的最終死亡率從36.7%升至43.3%；濃度為1.0×105～1.0×108孢子/mL時(shí)，5齡和6齡幼蟲(chóng)的最終死亡率分別從22.2%升至48.9%和2.23%升至16.7%，均低于50%，因此無(wú)LT50值。

表2 玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的致死中時(shí)間

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“-”表示草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的最終死亡率低于50%，無(wú)法估算LT50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-”represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LT50values cannot be estimated.

3 結(jié)論與討論

寄主昆蟲(chóng)的表皮是抵御病原真菌侵染的第一道屏障(Buttetal., 1995)，分生孢子在表皮的附著速度是影響菌株致病力的一個(gè)重要因素。玫煙色蟲(chóng)草分生孢子在寄主表皮上附著能力越強(qiáng)，其致病力也越強(qiáng)(Altreetal., 1999; Altre and Vandenberg, 2001)。本研究中的供試玫煙色蟲(chóng)草IFCF01接種于草地貪夜蛾4齡幼蟲(chóng)，分生孢子能夠從腹末、胸足基部、腹側(cè)體壁等區(qū)域附著和萌發(fā)進(jìn)入體內(nèi)，且在后期可在幼蟲(chóng)較堅(jiān)硬的頭殼成功侵入和菌絲生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株IFCF01對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)具有較好的附著和侵染能力。玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾1齡至6齡幼蟲(chóng)均有侵染效果，但齡期間的致病力差異較大，低齡幼蟲(chóng)對(duì)玫煙色蟲(chóng)草的敏感性高于高齡幼蟲(chóng)，尤其是1齡幼蟲(chóng)易受感染且致死時(shí)間短。在較適溫度下，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育迅速，尤其是低齡幼蟲(chóng)的歷期更短，僅1～2 d，蛻皮快，因此真菌孢子容易隨幼蟲(chóng)蛻皮而被剝離體表，但試驗(yàn)中供試菌侏對(duì)低齡幼蟲(chóng)仍有極高致病力，這可能與該菌株快速的入侵能力有關(guān)。與低齡幼蟲(chóng)相比，高齡幼蟲(chóng)的歷期較長(zhǎng)，為孢子侵染提供了更充足的時(shí)間，然而本試驗(yàn)中高濃度孢子懸浮液卻對(duì)6齡幼蟲(chóng)的致死率僅21.1%(1.0×109孢子/mL)，推測(cè)這可能與高齡幼蟲(chóng)的體壁結(jié)構(gòu)和免疫能力有關(guān)，即鱗翅目昆蟲(chóng)的低齡幼蟲(chóng)體壁較薄，真菌孢子更易穿透并完成侵染，而高齡幼蟲(chóng)體壁蠟質(zhì)層增厚，表皮硬化加強(qiáng)、幼蟲(chóng)免疫和代謝能力增強(qiáng)而更具抗病性(蒲蟄龍和李增智, 1996; Meyeretal., 2008)。

昆蟲(chóng)病原真菌致病力是篩選高效菌株的主要依據(jù)之一，也是衡量其防效潛力的重要指標(biāo)之一。死亡率越高且LT50越短，意味著病原真菌具有更好的致病力。據(jù)報(bào)道，用35株球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株和14株金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae對(duì)草地貪夜蛾進(jìn)行致病力篩選，僅有1株球孢白僵菌菌株Unioeste 26可導(dǎo)致草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)44.5%死亡率(Thomazonietal., 2014)。此外，另有報(bào)道1株球孢白僵菌菌株Bb 42對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的LC50為5.92×103孢子/mL，且1.0×109孢子/mL時(shí)，其2齡幼蟲(chóng)死亡率達(dá)96.6%，致死中時(shí)LT50為3.6 d(Garcíaetal., 2011)。本研究表明，對(duì)于齡期相同的2齡幼蟲(chóng)，供試玫煙色蟲(chóng)草IFCF01的LC50為1.17×105孢子/mL，略高于前者的5.92×103孢子/mL；當(dāng)處理孢子懸浮液也為1.0×109孢子/mL，1～3齡幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率均達(dá)100%，而且4齡幼蟲(chóng)的也達(dá)98.9%，較白僵菌的致病力強(qiáng)；再以 2齡幼蟲(chóng)LT50值比較，本研究的僅為1.65 d，較前者的致死速度快。分析表明，本研究中供試玫煙色蟲(chóng)草菌株具有較強(qiáng)的致病力。

本研究中的菌株IFCF01對(duì)高齡幼蟲(chóng)的LC50遠(yuǎn)大于低齡幼蟲(chóng)的LC50，在同一孢子濃度下對(duì)低齡幼蟲(chóng)的致病力大于高齡幼蟲(chóng)，尤其對(duì)草地貪夜蛾 4齡以下的幼蟲(chóng)侵染效果最好，因此利用玫煙色蟲(chóng)草防治草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的適期是低齡幼蟲(chóng)種群的高峰期。由于草地貪夜蛾對(duì)昆蟲(chóng)病原真菌的敏感性隨地理種群不同而產(chǎn)生變化(Lezama Gutiérrezetal., 2001)，因此菌株的致病力還可能與試蟲(chóng)地理種群、菌株本身生物學(xué)特性以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素有關(guān)。本研究中的玫煙色蟲(chóng)草IFCF01對(duì)草地貪夜蛾低齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病力，具有較高的研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)潛力，但如何發(fā)揮該株玫煙色蟲(chóng)草在草地貪夜蛾可持續(xù)防控中的作用仍需進(jìn)一步研究。