郭建軍， 熊大維， 曾 靜， 魏國(guó)汶， 杜建華， 袁 林*

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096；2.南昌工學(xué)院，江西南昌 330108）

糞腸球菌是人和動(dòng)物腸道的一類重要菌群，可參與機(jī)體多種代謝活動(dòng) （Ben等，2018；Hwanhlem等，2017），從健康動(dòng)物腸道分離的有益糞腸球菌可作為動(dòng)物微生態(tài)制劑，替代抗生素調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道平衡，提高抵抗力，抑制病原菌繁殖，防治動(dòng)物的一些腸道疾病等 （Amachawadi等，2018；Allameh 等，2017； Chen 等，2017）。 影響菌株生產(chǎn)能力的因素不僅包括菌種本身的生理性能，還有外界的環(huán)境條件（胡紅偉等，2019；白文妹等，2017）。所以通過(guò)優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件可改進(jìn)發(fā)酵過(guò)程。

高密度培養(yǎng)是指在一定的培養(yǎng)條件和體系內(nèi)，應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)在不影響胞內(nèi)產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上，盡可能多的提高生物量 （劉開(kāi)放等，2019）。研究表明，影響糞腸球菌增殖的因素有很多，如菌種的活力、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)周期、培養(yǎng)液的初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量和增殖因子等 （吳軍林等，2018；焦月華等，2016；喬琳等，2015）。乳酸菌要通過(guò)高密度培養(yǎng)技術(shù)有效的降低代謝產(chǎn)物濃度從而消除反饋抑制、降低發(fā)酵液的黏度、增大體系初始溶氧濃度達(dá)到理想的高濃度活菌含量，需要優(yōu)化一系列相關(guān)的工藝參數(shù)，從而對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的控制（劉香英等，2018）。目前已有一些對(duì)糞腸球菌益生菌高密度培養(yǎng)研究，但僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的小試水平，鮮見(jiàn)大規(guī)模中試水平的報(bào)道。本文在前期搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上研究了5 L機(jī)械攪拌罐中的發(fā)酵情況，對(duì)其中影響糞腸球菌生長(zhǎng)的主要因素，如氣體環(huán)境、攪拌速度、中和劑、發(fā)酵恒定pH和碳源添加量等進(jìn)行了考察，從而優(yōu)化糞腸球菌在發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件，為后續(xù)中試及生產(chǎn)放大提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試菌株：糞腸球菌EXW27由本實(shí)驗(yàn)室從健康仔豬腸道黏膜上選育并保藏。

種子和發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g、蛋白胨 20 g、酵母粉 9.0 g、檸檬酸氫二銨 3.5 g、K2HPO4·7H2O 3.75 g、NaAc·3H2O 6.25 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、MnSO4·H2O 0.45 g、組氨酸 1.4 g、碳酸鈣 10 g，pH 7.2，115 ℃滅菌 20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 將保存在-20℃的菌種解凍后，接入制備好的種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)18 h即得到種子液。發(fā)酵罐初始培養(yǎng)條件：將種子液以3%（V/V）接種于裝液量為70%的5 L小罐，攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，不通氣，恒定pH 6.2，37℃恒溫培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

活菌含量計(jì)數(shù)方法采用固體MRS傾注法，將待測(cè)發(fā)酵液用滅菌的磷酸鹽緩沖溶液按10倍梯度稀釋，至適宜梯度后取1 mL稀釋液加入培養(yǎng)皿中，用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，于37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)菌落總數(shù)，每個(gè)梯度3個(gè)平行值，結(jié)果以cfu/mL表示。

1.2.2 分批發(fā)酵條件優(yōu)化 在5 L液體發(fā)酵罐中對(duì)糞腸球菌分批進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選取影響因素包括氣體環(huán)境、攪拌速度、中和劑、發(fā)酵恒定pH和碳源添加量等進(jìn)行優(yōu)化，以最終收獲的發(fā)酵液中活菌數(shù)作為高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化指標(biāo)。每一步優(yōu)化的結(jié)果都用于下一步的發(fā)酵過(guò)程中，根據(jù)不同條件下菌體的生長(zhǎng)情況逐步確定最佳的小試發(fā)酵工藝。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)E.faecalis EXW27生長(zhǎng)影響大的三個(gè)因素：攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵恒定pH、碳源添加量，以乳酸菌活菌數(shù)為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken Design（BBD）響應(yīng)面設(shè)計(jì)，通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

1.2.3 補(bǔ)料分批培養(yǎng) 在分批培養(yǎng)最佳條件的基礎(chǔ)上，將種子液接種于5.0 L機(jī)械攪拌罐中，pH反饋補(bǔ)料分批培養(yǎng)，pH控制與補(bǔ)料關(guān)聯(lián)的參數(shù)設(shè)置為反向關(guān)聯(lián)，當(dāng)pH大于設(shè)定值時(shí)啟動(dòng)補(bǔ)料，在其他條件相同的情況下，以不補(bǔ)加葡萄糖發(fā)酵作為對(duì)照組。每隔2 h取樣，檢測(cè)發(fā)酵液中菌體活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)所用到的數(shù)據(jù)分析軟件：Design-Expert（8.0.6b），SPSSStatistics（17.0）。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同通氣方式對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 本試驗(yàn)研究不同的通氣條件[a.空氣（V（N2）： V（O2）=79：21），b.氮?dú)?，c.混合氣體（V（N2）：V（H2）：V（CO2）=80：10：10）]保壓 0.02 Mpa 對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，以不通氣作對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1中可以看出，不同的通氣條件對(duì)菌株EXW27的生長(zhǎng)影響差異不顯著。在空氣保壓的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)最高，氮?dú)獗汉突旌蠚怏w保壓對(duì)菌體的生長(zhǎng)無(wú)明顯促進(jìn)作用，活菌數(shù)比空氣保壓時(shí)低，這表明發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中的溶氧濃度對(duì)菌株EXW27的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，故選擇通空氣保壓。

2.1.2 攪拌速度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 提高攪拌轉(zhuǎn)速可以增加溶氧量，圖2表明，從發(fā)酵開(kāi)始至發(fā)酵4 h處，3種轉(zhuǎn)速條件下的菌株生長(zhǎng)情況一致，隨后，轉(zhuǎn)速為200 r/min菌株的生物量呈現(xiàn)先指數(shù)增加后緩慢減小的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min和300 r/min菌株的生物量上升緩慢。這說(shuō)明，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌株E.faecalis EXW27的生長(zhǎng)具有顯著的影響，過(guò)低會(huì)造成供氧不足，從而影響菌體生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)速過(guò)高產(chǎn)生的剪切力會(huì)對(duì)菌體造成一定損傷，使其過(guò)早衰亡或自溶。

2.1.3 不同中和劑對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 本試驗(yàn)比較12.5%氨水、4M NaOH溶液和3M Ca（OH）2溶液等不同的中和劑對(duì)試驗(yàn)菌種生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出，使用不同的中和劑菌體的生長(zhǎng)過(guò)程相似，隨著碳源的消耗菌體濃度不斷升高，穩(wěn)定期時(shí)用12.5%氨水做中和劑，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到了21.23×109cfu/mL，顯著高于用4M NaOH溶液和3M Ca（OH）2溶液做中和劑時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)（P＜0.05）。以氨水作為中和劑，既可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，也可作為氮源被菌體利用，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，氫氧化鈉與氫氧化鈣的效果明顯不如氨水，可能是在補(bǔ)堿的過(guò)程中使培養(yǎng)液中鹽離子濃度過(guò)高，影響了細(xì)胞內(nèi)外滲透壓與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運(yùn)輸，不利于菌體的生長(zhǎng)，因此選用12.5%氨水做中和劑。

2.1.4 不同pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 由圖4可知，恒定不同pH對(duì)E.faecalis EXW27菌體生長(zhǎng)影響差異性顯著（P＜0.05），pH維持較低水平時(shí)發(fā)酵時(shí)間偏長(zhǎng)，且活菌數(shù)最低；pH維持較高水平時(shí)產(chǎn)酸量大，導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期時(shí)間較短。當(dāng)發(fā)酵恒定pH為5.8時(shí)，E.faecalis EXW27進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期明顯加快，發(fā)酵時(shí)間適中，且發(fā)酵液活菌數(shù)最高，達(dá)到了22.97×109cfu/mL，綜合考慮，確定E.faecalis EXW27發(fā)酵恒定pH為5.8。

2.1.5 初始糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 為滿足菌體生長(zhǎng)繁殖的需要，本試驗(yàn)中將初始糖濃度從20 g/L逐漸增至50 g/L，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖5。

結(jié)果表明原培養(yǎng)基中的糖濃度無(wú)法滿足菌體在小試培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)需求，提高初始糖濃度發(fā)酵至穩(wěn)定期發(fā)酵液活菌數(shù)有顯著提升 （P＜0.05），但當(dāng)初始糖濃度大于40 g/L發(fā)酵液活菌增加不明顯，說(shuō)明較低濃度的糖對(duì)于菌體是一種碳源饑餓狀態(tài)。由于當(dāng)初始糖濃度為40 g/L時(shí)，進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間較其他處理最短，因此將培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度調(diào)為40 g/L。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定主效應(yīng)因素為攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵恒定pH、碳源添加量，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)E.faecalis EXW27培養(yǎng)條件進(jìn)行了3因素3水平試驗(yàn)，以發(fā)酵液活菌數(shù)（R）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表1中所得數(shù)據(jù)ANOVA分析，各因素經(jīng)過(guò)擬合得到的二次多項(xiàng)式回歸模型方程為R＝-93.653+29.061X1+0.658X2+ 0.049X3-0.025X1X2+0.004X1X3-0.001X2X3-2.601X12-0.005X22-0.001X32。

對(duì)回歸模型進(jìn)行可信度分析和方差顯著性檢驗(yàn)分析見(jiàn)表2。二次回歸模型的決定系數(shù)R2=0.99516，修正后決定系數(shù)R2Adj=0.98894，說(shuō)明有98.89%的差異可用此回歸模型來(lái)解釋；模型的P值為0.0001＜0.01，F(xiàn)值為373.53，均可說(shuō)明此模型顯著。且回歸方程中失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P值為0.8268），說(shuō)明未知因素對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)干擾性小，方程擬合度好。對(duì)于模型回歸方程系數(shù)的顯著性試驗(yàn)表明，一次項(xiàng)系數(shù)X1、X2、X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32和交互項(xiàng)X2X3對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)影響極顯著，交互項(xiàng)X1X2和X1X3可顯著影響發(fā)酵液活菌數(shù)。綜合表明該模型與試驗(yàn)值擬合很好，能夠較好地反映菌株E.faecalis EXW27發(fā)酵活菌數(shù)與攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵恒定pH、碳源添加量之間的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)E.faecalis EXW27液體高密度培養(yǎng)的活菌數(shù)在不同小試工藝條件下的變化規(guī)律。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 回歸方程的方差分析

固定其中的一個(gè)因素，做另外兩個(gè)因素交互作用的曲面圖及等高線圖，確定攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵恒定pH、初始糖濃度對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)的活菌數(shù)含量的影響。由圖6可知，攪拌轉(zhuǎn)速、發(fā)酵恒pH、初始糖濃度兩兩交互作用對(duì)乳酸菌數(shù)的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系，所得到的響應(yīng)面都存在一個(gè)極大值點(diǎn)，其中，初始糖濃度和攪拌轉(zhuǎn)速的交互作用極顯著，攪拌轉(zhuǎn)速和發(fā)酵恒定pH的交互作用較弱。在一定培養(yǎng)時(shí)間下，乳酸菌活菌數(shù)隨著培養(yǎng)初始糖濃度的上升而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在48 g/L時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著糖濃度升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在固定初始糖濃度時(shí)，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加，乳酸菌數(shù)出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上的各因素的最佳培養(yǎng)條件為：發(fā)酵恒定pH 5.49、初始糖濃度47.74 g/L、攪拌轉(zhuǎn)速164.42 r/min。為了驗(yàn)證響應(yīng)面模型的有效性，考慮到實(shí)際操作的方便性，將各因素修正為發(fā)酵恒定pH 5.5、初始糖濃度48 g/L、攪拌轉(zhuǎn)速165 r/min，在此修正條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出發(fā)酵液活菌菌數(shù)實(shí)際值為33.86×109cfu/mL，與預(yù)測(cè)值34.94×109cfu/mL較為接近，說(shuō)明采用響應(yīng)面法得到的該模型結(jié)果較為可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

2.3 pH反饋補(bǔ)料分批培養(yǎng) 在pH控制與補(bǔ)料相關(guān)聯(lián)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)反向關(guān)聯(lián)的方式，以pH為信號(hào)來(lái)流加葡萄糖液，即當(dāng)pH大于5.5時(shí)啟動(dòng)補(bǔ)料，反之停止補(bǔ)料。補(bǔ)料前的培養(yǎng)過(guò)程，通過(guò)流加酸堿使pH保持在5.5。流加模式為加2 s，停10 s，補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，在發(fā)酵開(kāi)始階段，發(fā)酵液的pH降低，蠕動(dòng)泵自動(dòng)加入12.5%氨水溶液使發(fā)酵過(guò)程中的pH維持在5.5，當(dāng)葡萄糖消耗殆盡之后由于氨基酸的脫氨基作用使pH增加，當(dāng)pH高于5.5時(shí)，補(bǔ)料泵自動(dòng)加入葡萄糖液。

從圖7可看出，補(bǔ)料發(fā)酵的條件下，菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)至18 h，顯著提高了發(fā)酵液活菌含量，菌體最終濃度在37.99×109cfu/mL以上，比對(duì)照組無(wú)補(bǔ)料分批發(fā)酵最終活菌濃度提高了11.2%，說(shuō)明pH反饋流加補(bǔ)料發(fā)酵方式優(yōu)于分批發(fā)酵方式。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，提高碳源添加量是提高發(fā)酵液活菌數(shù)的有效方法。

3 討論

試驗(yàn)通過(guò)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵糞腸球菌，初步研究糞腸球菌的液體發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)氣體環(huán)境、攪拌速度、中和劑、發(fā)酵恒定pH和初始糖含量等都會(huì)不同程度的影響糞腸球菌在發(fā)酵罐內(nèi)的生長(zhǎng)。E.faecalis EXW27屬于兼性厭氧菌，對(duì)溶氧量要求較為嚴(yán)格，因此選擇合適的氣體環(huán)境和攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)EXW27液體發(fā)酵是必要的；乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中將培養(yǎng)基的糖類代謝為有機(jī)酸，培養(yǎng)后期有機(jī)酸大量積累對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，為減輕培養(yǎng)過(guò)程中高酸環(huán)境對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制，通過(guò)流加中和劑使培養(yǎng)液的pH維持在菌體最適生長(zhǎng)范圍內(nèi)可以有效緩解這種抑制作用，從而提高菌體的生長(zhǎng)密度。針對(duì)不同的微生物或不同培養(yǎng)基質(zhì)，不同的中和劑所能達(dá)到的效果也不盡相同。本研究發(fā)現(xiàn)用12.5%氨水控制pH穩(wěn)定在糞腸球菌EXW27最適生長(zhǎng)范圍，可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，提高單位體積內(nèi)的活菌數(shù)，原因可能是氨水能中和發(fā)酵過(guò)程中過(guò)多的有機(jī)酸，又能為菌體生長(zhǎng)提供氮源，因此，解決乳酸菌菌體濃度低的方法有很多，但必須結(jié)合工藝過(guò)程的整體特點(diǎn)，全方位考慮才能使菌體濃度達(dá)到高密度。本研究分析了氣體環(huán)境、攪拌速度、中和劑、發(fā)酵恒定pH和初始糖含量等對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，減少代謝產(chǎn)物形成并使菌體以最大生長(zhǎng)率達(dá)到高密度培養(yǎng)，逐步優(yōu)化菌體的小試發(fā)酵工藝，使得發(fā)酵液最終活菌數(shù)在37.99×109cfu/mL 以上。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，糞腸球菌EXW27的小試發(fā)酵工藝為：將種子液以3%（V/V）接種于裝液量為70%的5 L小罐，攪拌轉(zhuǎn)速165 r/min，通空氣保壓0.02 Mpa，自動(dòng)流加12.5%的氨水控制pH恒定為5.5，當(dāng)pH高于5.5流加葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵18 h，減少代謝物有機(jī)酸形成，減輕酸環(huán)境對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，延長(zhǎng)生長(zhǎng)期，最終發(fā)酵液活菌數(shù)為37.99×109cfu/mL。