許小向 尹忠平* 劉澤波 嚴(yán)國(guó)榮 陳繼光 上官新晨，3

（1 江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 南昌330045

2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南昌330045

3 江西省食品藥品監(jiān)督管理局 南昌330045）

青錢柳[Cyclocarya Paliurus（Bata1）Iljinsk]又名搖錢樹、麻柳，為我國(guó)特有的雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬珍稀植物，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)，是江西省的特色資源。青錢柳中含有三萜、黃酮、多糖、皂甙、有機(jī)酸、甾醇和生物堿等多種活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎、降糖降脂等多種生理活性和藥理功能[1-5]，也可以作為甜味劑。由于青錢柳繁育困難，且自然資源緊缺，所以嚴(yán)重制約了對(duì)其的綜合開發(fā)利用。本實(shí)驗(yàn)室研究人員利用植物組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)出疏松且穩(wěn)定的青錢柳愈傷組織，并建立了穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮體系生產(chǎn)三萜酸[6]，有效解決了青錢柳資源匱乏導(dǎo)致的開發(fā)利用難題。為提高青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的三萜產(chǎn)量，郭春梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在接種后第8天添加150μmol/L硝普鈉，持續(xù)作用4 d后總?cè)扑岙a(chǎn)量達(dá)1 228.74mg/L，為對(duì)照組的2.14倍。熊瓊瓊等[8]在青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞接種后的第4天加入質(zhì)量濃度為200μg/mL的黑曲霉真菌誘導(dǎo)子，作用3 d后總?cè)飘a(chǎn)量達(dá)到對(duì)照組的10.21倍。上述研究表明，外源添加誘導(dǎo)子可以有效促進(jìn)青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)三萜酸，有助于實(shí)現(xiàn)三萜酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

三萜是青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的主要活性成分，為五環(huán)三萜類化合物，如熊果酸、齊墩果酸等。該類物質(zhì)是由異戊二烯焦磷酸（IPP）經(jīng)法尼基二磷酸合酶（FPS）催化形成法尼基焦磷酸（FPP），然后在鯊烯合成酶（SS）的作用下尾尾連接形成具有C30骨架的角鯊烯，角鯊烯再通過(guò)環(huán)化作用合成五環(huán)的三萜類化合物[9]。角鯊烯是所有三萜類化合物的共同前體，由鯊烯合成酶催化兩分子的法烯基焦磷酸（FPP）生成，因此鯊烯合成酶是三萜類化合物生物合成途徑中的一個(gè)重要調(diào)控酶和限速酶[10]。其含量和活性決定三萜化合物的產(chǎn)量，對(duì)調(diào)控三萜類物質(zhì)的合成具有重要作用。

目前研究人員從擬南芥、葡萄、甘草、煙草、水稻、人參、西洋參和柴胡等植物中克隆到相應(yīng)的鯊烯合成酶基因[11-14]，且發(fā)現(xiàn)添加外源誘導(dǎo)物質(zhì)可以影響鯊烯合成酶的表達(dá)水平，如茉莉酸甲酯（Me-JA）能夠顯著提高鯊烯合成酶基因的表達(dá)量[15]。以真菌誘導(dǎo)子處理煙草愈傷組織，可以減少愈傷組織中甾醇的合成量與積累量[16]。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的青錢柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以青錢柳懸浮細(xì)胞RNA為模板，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆鯊烯合成酶（CpSS）基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可為進(jìn)一步研究和調(diào)控三萜代謝提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳愈傷組織，由本實(shí)驗(yàn)室以青錢柳幼葉為外植體誘導(dǎo)獲得。

黑曲霉（編號(hào)CGMCC3.0453），購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

SMARTer RACE試劑盒、EasyPureRPlant RNA Kit、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、瓊脂糖、膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶和DNA Marker，北京全式金生物有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），天津永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司；電泳儀，美國(guó)Bio-Red公司；S1000-PCR儀，美國(guó)Bio-Red公司；超微量蛋白核酸測(cè)定儀，英國(guó)Biodrop Ulite公司；熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Red公司；5417R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；DYCP-31BM型水平電泳槽，北京市六一儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Bio-Red公司；恒溫?fù)u床，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及誘導(dǎo) 青錢柳細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)和黑曲霉誘導(dǎo)子的制備參照熊瓊瓊等[8]的方法。在細(xì)胞的對(duì)數(shù)期中期（第4天）添加質(zhì)量濃度為200μg/mL的黑曲霉真菌誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)，分別采集新鮮的未添加誘導(dǎo)子、誘導(dǎo)10，20，30，40 h和60 h的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞樣本，經(jīng)液氮速凍后于-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA提取和cDNA第1鏈的制備 采用植物RNA試劑盒提取青錢柳懸浮細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)其濃度、純度及完整性。用試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄試劑及自備引物5’CDS Primer A和3’CDS Primer A合成青錢柳5’和3’cDNA第1鏈。

1.3.3 CpSS全長(zhǎng)基因的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的青錢柳CpSS基因的cDNA序列分別設(shè)計(jì)5’和3’RACE引物（見表1），采用Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification試劑盒，以合成的5’和3’RACE cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得CpSS的5’-RACE片段和3’-RACE片段。PCR擴(kuò)增體系（50μL）：5’和3’RACE cDNA，2.5μL；2×SeqAmp Buffer，25μL；SeqAmp DNA Ploymerase，1.0μL；PCR-Grade H2O，15.5μL；10×UPM，5μL；5’和3’GSP，1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸3min，35次循環(huán)；72℃終延伸10min。應(yīng)用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，將純化產(chǎn)物與pUC19載體連接，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。采用DNAstar軟件將獲得的5’和3’序列進(jìn)行拼接，得到青錢柳CpSS全長(zhǎng)基因序列。根據(jù)拼接的CpSS的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物（引物見表1），克隆CpSS的全長(zhǎng)基因，以驗(yàn)證拼接的序列。

表1 引物設(shè)計(jì)表Table1 Design of primer

1.3.4 CpSS全長(zhǎng)基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)CpSS基因的克隆結(jié)果，利用NCBI中的ORF Finder預(yù)測(cè)CpSS基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)出氨基酸序列；利用Prot Param在線分析軟件對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行基本理化特性分析；利用Prot Scale進(jìn)行氨基酸序列的疏水性和親水性分析；利用SignalP4.1分析潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；利用SOPMA在線軟件對(duì)CpSS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用SWISS MODEL在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastp程序?qū)Π被徇M(jìn)行保守域預(yù)測(cè)及同源性分析；利用DNAMAN軟件對(duì)同源氨基酸進(jìn)行多重比對(duì)，用Clustalx和MEGA 5.02軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.5 CpSS基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 利用Primer 5.0設(shè)計(jì)CpSS基因的特異性引物。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參引物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)CpSS基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，檢測(cè)該基因在黑曲霉誘導(dǎo)青錢柳懸浮細(xì)胞不同時(shí)間的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取及CpSS基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

為獲得CpSS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中CpSS的序列為模板設(shè)計(jì)引物，利用RACE-PCR技術(shù)分別得到5’-RACE和3’-RACE產(chǎn)物片段，凝膠電泳和成像分析結(jié)果如圖1所示。5’-RACE和3’-RACE產(chǎn)物條帶單一明亮，將該兩條帶分別進(jìn)行切膠、回收、純化、克隆和測(cè)序，5’-RACE和3’-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為1 332 bp和896 bp。采用DNAstar軟件將5’-RACE和3’-RACE序列進(jìn)行拼接，得到CpSS基因全長(zhǎng)cDNA序列，其長(zhǎng)度1 667 bp。以拼接所得的CpSS序列為模板，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因特異性引物。以青錢柳cDNA為模板克隆CpSS全長(zhǎng)序列，結(jié)果（圖2）表明，克隆得到的CpSS序列與拼接的序列長(zhǎng)度一致。

2.2 CpSS基因序列分析

圖1 CpSS基因5'RACE和3'RACE產(chǎn)物凝膠電泳成像圖Fig.1 Gel electrophoresis image of 5'RACE and 3'RACE fragment of CpSS

圖2 CpSS基因全長(zhǎng)克隆電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis image of full length CpSS gene

ORF Finder預(yù)測(cè)結(jié)果表明，克隆得到的長(zhǎng)度為1 667 bp的CpSS基因全長(zhǎng)序列中包含一個(gè)1 245 bp的完整ORF，該ORF編碼414個(gè)氨基酸，如圖3所示。與NCBI中已收錄的序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)青錢柳鯊烯合成酶基因與胡桃的相似度最高，達(dá)97%，與白樺、葡萄、大豆、甘草、可可5種植物的相似度都達(dá)到85%。將CpSS所編碼的蛋白與其它植物相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與胡桃、白樺、葡萄、大豆的鯊烯合成酶基因所編碼的蛋白同源性在85%以上（如表2）。挑選8個(gè)同源性較高的物種，采用Cluster對(duì)CpSS的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CpSS基因的氨基酸序列與其它物種有較高的同源區(qū)，該區(qū)的氨基酸殘基的保守性較高。由此推測(cè)該區(qū)域可能是鯊烯合成酶的功能結(jié)構(gòu)域。

在線軟件ProtParam分析結(jié)果表明，CpSS編碼的多肽的原子組成為C2141H3377N571O596S28，含有6 713個(gè)原子，分子質(zhì)量為47 550.5 u，等電點(diǎn)p I為8.86，脂肪系數(shù)93.26，不穩(wěn)定系數(shù)為42.03，屬于不穩(wěn)定蛋白。在組成CpSS蛋白的20種氨基酸中，無(wú)酪氨酸和纈氨酸，亮氨酸（Leu）所占比例最高，達(dá)到10.4%，色氨酸含量最低，為1.0%，含有45個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，54個(gè)帶正電荷氨基酸殘基。利用ExPASy中的ProtScale分析可知，CpSS蛋白質(zhì)的氨基酸殘基中351位的親水性最強(qiáng)（MIN：-2.478），395位的疏水性最強(qiáng)（MAX：3.722），且親水性的氨基酸數(shù)量多于疏水性的氨基酸數(shù)量，推斷該蛋白為親水性蛋白。經(jīng)SignalP-4.1預(yù)測(cè)，CpSS編碼的氨基酸序列中沒有信號(hào)肽，不存在剪切位點(diǎn)，表明該蛋白翻譯后無(wú)需跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。利用PSORT Prediction預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明：該蛋白可能存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中。

采用Smart在線軟件分析CpSS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第282～304位和387～409位氨基酸區(qū)域。經(jīng)BLAST保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，CpSS蛋白含有典型的萜類代謝途徑酶的5個(gè)保守區(qū)功能，如圖4所示，分別為酶的底物結(jié)合域、底物-Mg2+結(jié)合位點(diǎn)、活性殘基位點(diǎn)、氨基酸殘基和兩個(gè)富含天冬氨酸域，與預(yù)測(cè)的香鱗毛蕨鯊烯合成酶基因的保守結(jié)構(gòu)域一致[17]。

圖3 CpSS核苷酸序列及氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence of CpSS

表2 青錢柳與其它物種同源性比對(duì)結(jié)果Table2 The homology between Cyclocarya paliurus and other plants

圖4 預(yù)測(cè)的CpSS蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 The forecasted conservative domins of CpSS

2.3 CpSS蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA預(yù)測(cè)了CpSS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。圖中上行為氨基酸序列，下行為其所對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中h代表α-螺旋（alpha helix）、e代表延伸鏈（extended strand）、t代表β-轉(zhuǎn)角（beta turn）、c代表無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CpSS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，h占66.18%，e占8.70%，t占5.07%，c占20.05%。由此可推測(cè)，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是CpSS的大量結(jié)構(gòu)元件，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。以SWISS MODEL對(duì)CpSS編碼氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖6）表明，該蛋白由多個(gè)α螺旋組成空穴狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成底物結(jié)合域與催化位點(diǎn)，這與大多數(shù)植物鯊烯合成酶的結(jié)構(gòu)相似。

圖5 CpSS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of CpSS

圖6 CpSS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Three dimensional structure of CpSS

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

根據(jù)CpSS編碼的蛋白序列在NCBI中的比對(duì)結(jié)果，下載30條同源性較高的蛋白序列，采用MEGA 6.0軟件分析其編碼的蛋白與其它物種的同源性，并選擇鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖7），結(jié)果表明CpSS基因的蛋白序列與白樺、胡桃聚為一類，表明與它們的親緣關(guān)系較近。

2.5 黑曲霉誘導(dǎo)子作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞CpSS的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在黑曲霉誘導(dǎo)子的作用下，從誘導(dǎo)時(shí)開始到60 h內(nèi)，CpSS的表達(dá)量顯著增加，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)（如圖8所示）。與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)后60 h時(shí)CpSS的表達(dá)量為對(duì)照組5.62倍。本文發(fā)現(xiàn)的CpSS在黑曲霉誘導(dǎo)子誘導(dǎo)后的表達(dá)變化情況與熊瓊瓊等[8]研究的青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中總?cè)坪康淖兓闆r一致，說(shuō)明黑曲霉誘導(dǎo)子通過(guò)促進(jìn)青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞CpSS的表達(dá)量來(lái)提高三萜的合成量。

圖7 基于鯊烯合成酶分析的青錢柳系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Cyclocarya paliurus based on the CpSS analysis

圖8 黑曲霉誘導(dǎo)子作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞鯊烯合成酶基因的表達(dá)變化Fig.8 Relative expression changes of CpSS in Cyclocarya paliurus suspension cells induced by Aspergillus niger elicitor

3 討論

采用RACE-PCR技術(shù)首次從青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中克隆到一個(gè)鯊烯合成酶基因，命名為CpSS。該基因包含一個(gè)1 245 bp的完整ORF。通過(guò)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與許多已克隆物種的SS基因序列有很高的同源性，且該基因編碼的蛋白與已報(bào)道的多種植物的SS具有相同的活性保守區(qū)，表明在植物進(jìn)化中SS蛋白的催化功能結(jié)構(gòu)域是高度保守的。

三萜類物質(zhì)是青錢柳懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的主要活性成分，為五環(huán)三萜類化合物。鯊烯合成酶（SS，EC 2.5.1.21）是三萜類化合物生物合成途徑中的一個(gè)重要調(diào)控酶和限速酶，可以催化兩分子法尼基二磷酸（FPP）縮合形成角鯊烯二磷酸（PSPP），而后在NADPH和Mg2+的輔助下[18]，PSPP經(jīng)過(guò)重排反應(yīng)轉(zhuǎn)化為角鯊烯，這是生物合成三萜的必要途徑[19]。鯊烯合成酶對(duì)三萜的合成具有重要作用，其含量和活性決定了三萜的產(chǎn)量，因此研究該酶的結(jié)構(gòu)和表達(dá)對(duì)于探索植物三萜代謝機(jī)制和調(diào)控三萜合成具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)外源添加誘導(dǎo)子調(diào)節(jié)合成途徑中相關(guān)酶的表達(dá)，可以有效調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成。Suzuki H等[20]研究表明，在蒺藜苜蓿懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中添加一定濃度的MeJA可以促進(jìn)SS基因的表達(dá)。在甘草細(xì)胞中加入MeJA誘導(dǎo)后，不僅提高了SS酶的活性，而且提高了終產(chǎn)物大豆皂苷的積累量[21]。本文qRTPCR檢測(cè)結(jié)果表明，CpSS基因的表達(dá)量在黑曲霉誘導(dǎo)子作用下顯著提高，誘導(dǎo)60 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大，誘導(dǎo)作用下CpSS表達(dá)量的變化與懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中總?cè)坪康淖兓嘁恢耓8]。綜上所述，通過(guò)各種誘導(dǎo)技術(shù)來(lái)調(diào)控CpSS的表達(dá)量，進(jìn)而達(dá)到提高三萜產(chǎn)量的目的。