李曉霞 王 歡 孫京利 張紅星 謝遠(yuǎn)紅

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京102206）

甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（Mannose-6-phosphate isomerase）廣泛存在于微生物中，如嗜糖假單胞菌（Pseudomonas saccharophi）[1]、放射形土壤桿菌（Agrobacter aerogenes）[2]、鏈霉菌（Streptomyces aerocolonigenes）[3]、大腸桿菌（Escherichia coli）[4]等。甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在植物遺傳轉(zhuǎn)化中作為選擇性標(biāo)記PMI/甘露糖系統(tǒng)也被廣泛利用[5-7]。大腸桿菌中，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在糖代謝系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的可逆性轉(zhuǎn)化[8-9]。大腸桿菌通過甘露糖PTS系統(tǒng)磷酸化將甘露糖、果糖等轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)，甘露糖6-磷酸異構(gòu)酶進(jìn)一步將甘露糖-6-磷酸異構(gòu)化成果糖-6-磷酸，從而促進(jìn)糖的代謝：甘露糖的羥基從C-1位轉(zhuǎn)移到C-2位，使甘露糖-6磷酸由醛式轉(zhuǎn)變成酮式的果糖-6-磷酸，其C-1位上即形成自由羥基。果糖-6磷酸進(jìn)入中心代謝途徑被代謝吸收[10]。研究發(fā)現(xiàn)甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶具有將甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的能力，是糖酵解途徑的中間體[11]，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在糖代謝中發(fā)揮著重要作用。然而甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在大腸桿菌不同碳源代謝過程中發(fā)揮的功能目前未見報(bào)道。

本研究采用二型內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄突變方法[12-14]構(gòu)建manA基因突變大腸桿菌，分析manA基因突變菌株對(duì)碳源的利用情況以及對(duì)大腸桿菌糖代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，以探討甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶對(duì)大腸桿菌糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌BL21（DE3）【基因型：F-ompT hsdS（rB-mB-）gal dcm（DE3）】菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

pADC4k-C（kanrand chlr）載體，Sigma公司（TargeTronRBacterial Gene Knockout System Kit TA0100-3EA）。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（g/L）氯化鈉20 g，胰蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，固體培養(yǎng)基加入15 g瓊脂。

2）甘露糖-LB培養(yǎng)基（g/L）氯化鈉20 g，胰蛋白胨20 g，甘露糖10 g。

3）果糖-LB培養(yǎng)基（g/L）氯化鈉20 g，胰蛋

白胨20 g，果糖10 g。

4）葡萄糖-LB培養(yǎng)基（g/L）氯化鈉20 g，胰蛋白胨20 g，葡萄糖10 g。

5）淀粉-LB培養(yǎng)基（g/L）氯化鈉20 g，胰蛋白胨20 g，淀粉10 g。

1.1.3 試劑與儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒DP103-02，天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒AK4302、Hind III和BsrG I限制性內(nèi)切酶，寶生物大連有限公司；EZ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒B610363，生工生物工程（北京）股份有限公司；IPTG，北京全式金生物技術(shù)有限公司；TargeTronR基因敲除試劑盒TA0100-3EA，Sigma公司產(chǎn)品。超微量核酸蛋白測定儀，Analytikjena公司；7500 Fast熒光定量PCR儀，ABI公司；WBS-100微生物比濁法測定儀，北京先驅(qū)威技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.2 研究方法

1.2.1 大腸桿菌manA基因Group II intron片段PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中大腸桿菌甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（CAQ32089.1）基因序列，在sigmaaldrich.com/targetronaccess上進(jìn)行manA基因Group II intron引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。

IBS-manA、EBS1d-manA、EBS2-manA、EBS Universal引物混合，混合體系見表2。

以TargeTronR基因敲除試劑盒中的Group II intron為模板，采用PCR方法擴(kuò)增manA基因Group II intron片段，PCR擴(kuò)增體系見表3。PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性94℃，2min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃，延伸2min。擴(kuò)增的manA基因的Group II intron的PCR產(chǎn)物使用EZ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 ManA基因Group II intron PCR引物Table1 ManA gene Group II intron PCR primers

表2 引物混合體系Table2 Primer mixing systems

1.2.2 基因突變重組載體的構(gòu)建 PCR純化產(chǎn)物（25 ng/μL）使用限制性核酸內(nèi)切酶Hind III（20 U/mL）和Bsr G I（10 U/mL）在37℃，30min；60℃，30min；80℃，10min條件下酶切。酶切后使用EZ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收manA基因Group II intron酶切產(chǎn)物。

表3 ManA基因Group II intron PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table3 PCR reaction system of manA gene amplification

使用T4 DNA連接酶將manA基因Group II intron酶切產(chǎn)物與線性化載體pADC4k-C按物質(zhì)的量比3∶1在4℃連接12 h。采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[11]，在含100μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化菌落。挑取陽性轉(zhuǎn)化菌落至含100μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12 h。采用細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒DP103-02提取陽性轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒，所得manA基因突變重組質(zhì)粒命名為pADC4k-C-manA。

1.2.3 ManA基因突變大腸桿菌的構(gòu)建 將pADC4k-C-manA重組質(zhì)粒采用熱激轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）[15]。在37℃恒溫培養(yǎng)1 h，取100μL轉(zhuǎn)化物加入3mL 25mg/mL氯霉素和1%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.2，加入2 mL含0.5 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)30min。將培養(yǎng)產(chǎn)物加入1mL 1%葡萄糖LB液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)1 h。取上述培養(yǎng)物涂布于含25μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，30℃恒溫過夜培養(yǎng)。

1.2.4 ManA基因突變大腸桿菌的鑒定 挑取陽性菌落在含25μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02提取突變株基因組DNA。以提取基因組DNA為模板，使用特異性引物〔manA F（5′-CGGCGTTGACTGAACTTTA-3′）和manA R（5′-GAACAGACCGCTGTCTTCC-3′）〕進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95℃變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。采用瓊脂糖凝膠（1%）電泳法檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。確定manA基因突變的大腸桿菌命名為BL21（DE3）ΔmanA。

1.2.5 不同碳源培養(yǎng)基中大腸桿菌生長曲線測定將大腸桿菌BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA以108CFU/mL[16]的初始接菌量接種于含1%不同碳源（甘露糖、果糖、葡萄糖、淀粉）的LB液體培養(yǎng)基中，在微生物比濁法測定儀上37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。每間隔2 h檢測菌液OD600值，繪制生長曲線。

1.2.6 熒光定量PCR 大腸桿菌BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA以108CFU/mL[15]的初始接菌量接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，采用玻璃珠-酚仿法[17]提取大腸桿菌BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real-time PCR方法檢測大腸桿菌糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，引物序列見表4。Real-time PCR反應(yīng)程序：95℃變性2min；95℃變性15 s，60℃退火1min，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線：從60℃到95℃，每1℃5 s的增量，確定引物特異性[18]。

表4 Real-time PCR引物序列Table4 Real-time PCR primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 ManA基因Group II intron片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

通過設(shè)計(jì)特異性引物IBS-manA、EBS1dmanA、EBS2-manA、EBS Universal，采用PCR方法擴(kuò)增manA基因Group II intron片段，結(jié)果如圖1所示。通過PCR擴(kuò)增到一條長度約為350個(gè)堿基的基因條帶，與預(yù)期Group II intron片段產(chǎn)物長度一致。DNA測序結(jié)果表明該片段為大腸桿菌manA基因的Group II intron片段。

圖1 ManA基因Group II intron片段PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of manA gene Group II intron fragment

2.2 BL21（DE3）ΔmanA 鑒定結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌manA基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR的方法驗(yàn)證基因突變。如圖2所示，野生型大腸桿菌BL21（DE3）PCR擴(kuò)增到長度為610 bp的基因片段，BL21（DE3）ΔmanA突變菌株P(guān)CR得到長度約為2.6 kb的DNA片段，表明BL21（DE3）ΔmanA菌株基因組manA編碼基因中插入了Group II intron片段。DNA測序結(jié)果表明，Group II intron插入位點(diǎn)在manA基因讀碼框的277～278個(gè)堿基處，表明BL21（DE3）△manA菌株構(gòu)建成功。

圖2 PCR鑒定大腸桿菌manA基因突變Fig.2 PCR identification of Escherichia colimanA gene mutation

2.3 BL21（DE3）ΔmanA 在甘露糖培養(yǎng)基中的生長曲線

大腸桿菌BL21（DE3）ΔmanA和BL21（DE3）在含甘露糖LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線如圖3所示。在0～2 h內(nèi)，BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA的生長曲線相似，細(xì)胞生長無顯著性差異性（P＜0.05）。與BL21（DE3）菌株相比，BL21（DE3）ΔmanA菌株在4～12 h時(shí)細(xì)胞生長能力下降，生長趨勢明顯低于BL21（DE3）（P＜0.05）。當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期，BL21（DE3）ΔmanA菌株的光密度顯著低于BL21（DE3）菌株（P＜0.05），表明manA基因的突變顯著影響大腸桿菌對(duì)甘露糖的利用，導(dǎo)致突變菌株的生長能力下降。

2.4 BL21（DE3）ΔmanA 在果糖培養(yǎng)基的中生長曲線

如圖4所示，0～4 h內(nèi)，BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA菌株的生長無顯著性差異（P＜0.05）；6～12 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株的細(xì)胞生長能力顯著性低于BL21（DE3）（P＜0.05），對(duì)果糖的利用率低。

2.5 BL21（DE3）ΔmanA菌株在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線

如圖5所示，當(dāng)BL21（DE3）ΔmanA菌株在含葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，BL21（DE3）ΔmanA菌株在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期對(duì)葡萄糖的利用與對(duì)照菌株BL21（DE3）無顯著性差異（P＜0.05），表明編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的突變不影響大腸桿菌對(duì)葡萄糖的利用。

2.6 BL21（DE3）ΔmanA菌株在淀粉培養(yǎng)基中的生長曲線

在以淀粉為碳源的LB液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，0～2 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株和BL21（DE3）對(duì)淀粉的利用沒有顯著性變化（P＜0.05）。在4～12 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株快速利用淀粉并加速細(xì)胞的生長，使得BL21（DE3）ΔmanA菌株對(duì)淀粉的利用顯著高于BL21（DE3）（P＜0.05），說明manA基因突變導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)淀粉的利用率提高。

圖3 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在甘露糖-LB中的生長曲線Fig.3 The growth curve of BL21（DE3）ΔmanA and BL21（DE3）in mannose-LB

圖4 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在果糖-LB中的生長曲線Fig.4 The growth curve of BL21（DE3）ΔmanA and BL21（DE3）in fructose-LB

圖5 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在葡萄糖-LB中的生長曲線Fig.5 The growth curve of BL21（DE3）ΔmanA and BL21（DE3）in glucose-LB

圖6 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在淀粉-LB中的生長曲線Fig.6 The growth curve of BL21（DE3）ΔmanA and BL21（DE3）in starch-LB

2.7 BL21（DE3）ΔmanA菌株糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)

采用Real-time PCR檢測BL21（DE3）ΔmanA菌株中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果見圖7。大腸桿菌manA基因突變導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄水平上，manA基因表達(dá)極顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)，manA基因突變導(dǎo)致編碼大腸桿菌甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IIABMan、IICMan、IIDMan亞基的manX、manY和manZ基因的表達(dá)量全部顯著性下調(diào)。甘露糖代謝過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，D-甘露酸脫水酶/甘露酸脫水酶編碼基因uxuA和果糖還原酶編碼基因uxuB表達(dá)的顯著降低，表明甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的功能缺失造成甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶PTS系統(tǒng)的變化；同時(shí)，manA基因的突變引起6-磷酸果糖激酶I亞基的編碼基因（pfkA）的低表達(dá)（P＜0.05），并且水解淀粉的α-淀粉酶編碼基因malS的顯著性上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)manA突變菌株對(duì)于淀粉的高效利用。

3 討論

圖7 BL21（DE3）ΔmanA 大腸桿菌糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)Fig.7 Expression of glucose metabolism genes in Escherichia coli

大腸桿菌中，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在碳源的代謝過程中負(fù)責(zé)糖的異構(gòu)化[19]。采用II型內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄突變方法突變編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的manA基因，發(fā)現(xiàn)BL21（DE3）ΔmanA菌株在LB培養(yǎng)基中的生長狀況與原始菌株無顯著性差異（結(jié)果未顯示），而對(duì)甘露糖的利用率顯著性降低（圖3）。在大腸桿菌中，甘露糖的代謝主要是由PTS系統(tǒng)中親水亞基IIAB負(fù)責(zé)磷酸化，疏水亞基IIC負(fù)責(zé)內(nèi)質(zhì)化，甘露糖被甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶異構(gòu)化成6-磷酸果糖[10]。當(dāng)編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因突變后，在LB培養(yǎng)基中雖不影響菌株的生長，但在突變株中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)量不同（圖7）。糖酵解的中間體合成受到抑制，代謝過程中必要的磷酸激酶基因的表達(dá)量顯著降低（圖7），造成甘露糖的利用率降低。當(dāng)編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因被突變后，引起甘露糖PTS系統(tǒng)的3個(gè)亞基的編碼基因（manX，manY，manZ）表達(dá)量下降（圖7），表明manA基因的突變造成甘露糖PTS系統(tǒng)發(fā)生變化。Rhiel等[20]的研究也有相似結(jié)果，IIABMan，IICMan和IIDMan3個(gè)亞基通過甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)甘露糖、葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和相關(guān)的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶促進(jìn)其對(duì)糖的磷酸化吸收。在果糖的代謝中也檢測到和甘露糖類似的結(jié)果（圖4），由于果糖的代謝通過甘露糖PTS系統(tǒng)被磷酸化和運(yùn)輸，因此，果糖的后期代謝吸收與甘露糖的代謝途徑相同[21]。

ManA突變菌株雖然引起糖酵解過程中的6-磷酸果糖激酶的基因（pfkA）的顯著性低表達(dá)（圖7），但對(duì)于葡萄糖的利用沒有發(fā)生顯著性變化（圖3）。當(dāng)manA基因被突變后，C-1位或C-2位的修飾發(fā)生變化，EII對(duì)于C-6位點(diǎn)修飾的葡萄糖和甘露糖具有高的磷酸化水平，相反，C-1或C-2位點(diǎn)的修飾能夠抑制其被磷酸化[18]。葡萄糖的異構(gòu)化雖然受到影響，但葡萄糖的代謝利用主要通過EIIGlc和葡萄糖透性酶作用消化吸收碳源和維持葡萄糖代謝的平衡[22]。然而，manA基因突變使得編碼α-淀粉酶的malS基因上調(diào)2.18倍，α-淀粉酶的主要作用與α-1，4糖苷鍵水解淀粉[23]，使淀粉被細(xì)胞代謝利用（圖6）。

4 結(jié)論

采用II型內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄突變方法成功構(gòu)建manA基因突變菌BL21（DE3）ΔmanA。通過研究BL21（DE3）ΔmanA菌株和野生型大腸桿菌的糖代謝吸收及糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以甘露糖和果糖為碳源時(shí)，菌株生長受到顯著抑制；而以淀粉為碳源時(shí)，BL21（DE3）ΔmanA菌株的生長明顯優(yōu)于野生型大腸桿菌；當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，manA基因突變對(duì)大腸桿菌生長無顯著影響。進(jìn)一步研究糖代謝基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BL21（DE3）ΔmanA菌株中甘露糖代謝相關(guān)基因（manX，manY，manZ）的表達(dá)顯著性降低；果糖代謝途徑中6-磷酸果糖激酶I亞基的編碼基因（pfkA）的表達(dá)顯著降低；水解淀粉的α-淀粉酶的編碼基因（malS）的表達(dá)顯著性增高。結(jié)果表明manA基因突變影響大腸桿菌甘露糖、果糖和淀粉代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響大腸桿菌對(duì)碳源（甘露糖、果糖、淀粉）的利用。