石夢玄 張 璐，2 田美玲 陳 芳*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點實驗室教育部果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083

2 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學 北京100193）

腸道是體內(nèi)消化代謝的重要器官之一，腸腔內(nèi)環(huán)境極其復雜，棲息了1013～1014個腸道微生物[1]。大量研究表明，這些微生物能夠維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡。腸道菌群中的益生菌，能夠在腸道中與致病菌競爭抑制其生長[2]，增強腸道屏障功能[3]。菌群代謝碳水化合物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（Shortchain fatty acids，SCFAs）[4]，能夠調(diào)節(jié)上皮細胞和免疫細胞的生長，調(diào)節(jié)氧化應激，影響?zhàn)ひ簩拥慕M成[5]。腸道中有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的增加對維持腸道功能，保護腸道健康具有重要作用。

果蔬包含的功能成分如膳食纖維和多酚，能夠與腸道菌群相互作用，改善腸道微生態(tài)環(huán)境[6-7]。膳食纖維不易被人體直接吸收，但可被腸道菌群代謝產(chǎn)生SCFAs，反之，SCFAs為腸道上皮細胞提供能量來源，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境pH值[8]。多酚能夠抑制腸道致病菌如類桿菌、腸球菌和葡萄球菌等的生長，促進雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數(shù)量的增加，維持菌群結(jié)構(gòu)平衡[9]。不同果蔬成分組成的差別會對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生不同的影響，因此選擇方便快捷、靈敏準確的研究方法初步評價不同果蔬的益生元功效有重要意義。

目前，人體腸道模擬系統(tǒng)（Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem，SHIME）[10]、三聯(lián)體外發(fā)酵模擬系統(tǒng)[11]等體外模擬消化體系具有精確度高、重現(xiàn)性好、操作便捷的優(yōu)點，逐漸在食品消化代謝研究中得到廣泛運用。本研究通過建立體外模擬腸道微生態(tài)體系，研究了絲瓜、香菇、桑葚和枸杞4種果蔬凍干全粉對5種腸道有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的影響，為初步評價果蔬的益生元功效提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“寧杞五號”枸杞、“808”香菇和“黑珍珠”桑葚全果凍干粉由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。市售“棒絲瓜”鮮果切片、凍干、研磨后得絲瓜凍干粉。

葡萄糖標準品（98%）、果糖標準品（99%）、蔗糖標準品（99%）、乙酸標準品（99.8%）、丙酸標準品（99.8%）、丁酸標準品（99.5%）、異戊酸標準品（98.5%），熱穩(wěn)定α-淀粉酶（TDF-100A）、淀粉葡萄糖苷酶（TDF-100A）、蛋白酶（TDF-100A）、豬胃粘膜胃蛋白酶（250 units/mg）、豬胰腺胰蛋白酶（～1 500U/mg）、豬胰腺胰酶（8×USP）、豬胃黏蛋白（Type II），美國Sigma公司；色譜級甲醇、乙腈，美國Honeywell公司；蛋白胨、酵母提取物、三號膽鹽，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；L-Cysteine（97%），美國Sigma-Aldrich公司；糞便基因組DNA提取試劑盒DP328，北京天根生化科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq，日本TaKaRa公司；Folin-Phenol試劑，北京索萊寶科技有限公司；分析純無水乙醇、葡萄糖、NaOH、K2HPO4、KH2PO4，國藥集團化學試劑有限公司（滬試）；腸道菌群特異性引物，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 設(shè)備與儀器

IS-RSD3臺式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；LAI-3DT型厭氧培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SpectraMax iD5多功能微孔讀板機，美國Molecular Devices公司；LightCycler480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀，德國Roche公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Waters RIDetector檢測器，美國Waters公司；Luna NH2色譜柱（250mm×4.6mm，5cm），美國Phenomenex公司；Agilent Technologies 7890B-5977A氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent Technologies公司；HP-FFAP色譜柱（19091F-413），美國Agilent Technologies公司

1.3 方法

1.3.1 體外模擬腸道微生態(tài)體系的建立 模擬胃液和小腸液分別參照Tedeschi等[12]的方法配制，并進行部分調(diào)整。模擬胃液：3.10 g NaCl，1.10 g KCl，0.15 g CaCl2，0.60 g NaHCO3，用去離子水定容1 000mL。在150mL胃電解液中添加35.40 mg胃蛋白酶，加入1.5 mL CH3COONa緩沖液（1.0 mol/L，pH 5.0）。室溫下磁力攪拌10min，調(diào)至pH 2.0（0.5 mol/L HCl）。模擬小腸液：5.40 g NaCl，0.65 g KCl，0.25 g CaCl2，去離子水定容1 000 mL。將25mL小腸電解液、50mL 4%膽汁鹽溶液和25mL 7%胰酶上清液混合，添加13mg胰蛋白酶，調(diào)至pH7.0（0.5mol/L NaOH）。

發(fā)酵培養(yǎng)基參照Chen等[13]的方法配制，并進行部分調(diào)整。0.10 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4，0.01 g CaCl2，2.00 g NaHCO3，2.50 g蛋白胨，4.00 g酵母提取物，0.40 g葡萄糖，2.00 g黏蛋白，0.50 g膽鹽，0.46 g L-Cysteine，2mL Tween-80，用去離子水定容1 000mL，調(diào)至pH 7.0（0.5mol/L NaOH），121℃高壓濕熱滅菌15min，冷卻后備用。

糞便菌群懸液參照Qiao Ding等[14]的方法配制。采集新鮮小鼠糞便，加入pH 7.0無菌PBS緩沖液，以1∶9（m/V）混合稀釋，均質(zhì)10min，1 000 r/min離心10min，去除雜質(zhì)，取上層渾濁液為糞便菌群懸液。

體外發(fā)酵方法參照Qiao Ding等[14]方法，并進行部分調(diào)整。于10mL離心管中以5%的體積比加入模擬胃液，加入質(zhì)量比1%果蔬凍干粉充分混勻，在37℃恒溫振蕩1.5 h（120 r/min）后，立即加入模擬小腸液（體積比為5%）充分混勻，恒溫振蕩1.5 h（120 r/min，37℃），得到果蔬粉消化液。按體積比6∶3∶1混合培養(yǎng)基、模擬腸道菌群液和果蔬粉消化液，于37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h，分別于0，3，6，12，24 h取樣5mL，12 000 r/min離心10min，沉淀和上清液分別保存-80℃待測。以不添加果蔬凍干粉為對照組。

1.3.2 果蔬凍干全粉主要碳水化合物及總酚含量測定 參考HPLC-RID法[15]測定果蔬凍干粉中葡萄糖、果糖和蔗糖含量。參考AOAC 991.43法[16]測定總膳食纖維含量。采用Folin-Ciocalteu法[17]測定總酚含量，依據(jù)沒食子酸標準曲線計算總酚含量，表示為mg/100 g。

1.3.3 有益菌數(shù)量的測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）絕對定量法[18]測定樣品中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、普氏菌屬（Prevotella）、擬 桿菌屬（Bacteroides）和阿克曼氏菌（Akkermansia mucinipila）5種有益菌數(shù)量。選擇總菌及上述5種有益菌的特異性擴增引物，采用基因克隆方法構(gòu)建相應有益菌的質(zhì)粒標準品，以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標準品為模板，利用特異性引物（表1）進行qPCR測定，繪制目的細菌的標準曲線。

以總DNA為模板，利用特異性引物（表1）進行qPCR測定。擴增體系（10μL）：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ5μL，正、反向引物各0.25 nmol，模板DNA 1μL，ddH2O補足10μL。反應程序：預變性95℃，30 s；變性95℃，5 s；退火60℃，15 s，40個循環(huán)；延伸72℃，30 s；復性95℃，10 s。將Cq值代入對應標準曲線中計算拷貝數(shù)，表示為copies/mL。

表1 腸道菌群菌屬引物序列Table1 Sequence of primers for intestinal microbiota

1.3.4 SCFAs含量測定 參照Hu等[21]的方法測定上清液樣品中SCFAs的含量。取800μL上清液加入200μL 50%濃硫酸漩渦混勻后，立即加入1 mL乙醚漩渦1min，冰上靜置10min，12 000 r/min離心10min，加入無水CaCl2脫水后，吸取上清過膜待測（0.22μm，尼龍膜）。采用HP-FFAP色譜柱，用氣-質(zhì)譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸，外標法計算各短鏈脂肪酸的質(zhì)量濃度。檢測器為氫火焰檢測器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID），載氣為N2，流速19.0mL/min，分流比1∶10，空氣流速300mL/min，H2流速為30mL/min。檢測器溫度250℃，進樣口溫度240℃，初始溫度80℃（0.5 min），升溫至150℃（4℃/min），然后升溫至230℃（20℃/min）保持10min。進樣量1μL，重復3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析（ANOVA）用于比較不同組之間的差異，結(jié)果以±SD表示，a、b、c、d表示不同組之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 4種果蔬凍干粉的主要碳水化合物及多酚含量

對4種果蔬凍干粉中總膳食纖維、總可溶性糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和總酚含量進行測定（見表2）?？偵攀忱w維含量最高的是香菇為24.37 g/100 g，之后為絲瓜17.89 g/100 g?？扇苄蕴呛孔罡呤巧］?5.75 g/100 g，其次為枸杞和絲瓜，分別為46.43 g/100 g和32.85 g/100 g。在可溶性糖組成上，香菇中葡萄糖含量是23.20 g/100 g，果糖和蔗糖未檢出；桑葚的果糖含量較高為32.65 g/100 g，葡萄糖、蔗糖相對較少，分別為18.58，14.52 g/100 g；枸杞中主要為葡萄糖和果糖，分別為22.24 g/100 g和22.64 g/100 g；絲瓜中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量分別為10.52，7.23 g/100 g和8.26 g/100 g。4種果蔬凍干粉均含有多酚，其中桑葚總酚含量最高，為5.58mg/100 g。

表2 果蔬凍干粉營養(yǎng)成分（g/100g）Table2 The nutritional components of fruit and vegetable freeze-dried powders（g/100g）

2.2 體外模擬腸道微生態(tài)體系中4種果蔬凍干粉對菌群數(shù)量的影響

對照組體外發(fā)酵0～12 h總菌數(shù)量明顯上升（圖1a），12～24 h趨向平穩(wěn)，表明該體系有利于腸道菌群進行發(fā)酵。有研究表明雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬是生物體腸道內(nèi)重要的益生菌[22-23]；普氏菌屬和擬桿菌屬是健康人體腸道菌群中的主導菌種[24]，為人體提供營養(yǎng)并維持腸道的正常生理功能；阿克曼氏菌能夠改善腸道屏障功能，被稱為潛在益生菌[25]。采用膳食補充等手段促進有益菌數(shù)量的增加，對維護人體腸道健康十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，4種果蔬凍干粉分別對雙歧桿菌屬、乳酸菌屬、普氏菌屬、擬桿菌屬和阿克曼氏菌數(shù)量的增加產(chǎn)生了不同程度的影響。桑葚、枸杞和絲瓜自發(fā)酵6 h起促進雙歧桿菌屬數(shù)量增加（圖1b），24 h時顯著高于對照和香菇組（P＜0.05）。桑葚、枸杞和絲瓜自發(fā)酵3 h起顯著促進乳酸桿菌屬數(shù)量增加（圖1c），且顯著高于對照和香菇組（P＜0.05）。絲瓜自體外發(fā)酵6 h起顯著促進普氏菌屬和擬桿菌屬數(shù)量增加（圖1d-1e），12 h和24 h時均顯著高于其它各組（P＜0.05）。然而，果蔬各組均未能顯著促進阿克曼氏菌數(shù)量的增加（P＜0.05），如圖1f所示。

圖1 體外發(fā)酵各組（a）總菌、（b）雙歧桿菌屬、（c）乳酸菌屬、（d）普氏菌屬、（e）擬桿菌屬和（f）阿克曼氏菌數(shù)量變化Fig.1 The number of（a）all bacteria，（b）Bifidobacterium，（c）Lactobacillus，（d）Prevotella，（e）Bacteroides，and（f）Akkermansia mucinipila in the in vitro fermentation system

2.3 體外模擬腸道微生態(tài)體系中4種果蔬凍干粉對短鏈脂肪酸含量的影響

腸道菌群主要代謝產(chǎn)物為SCFAs，包括乙酸、丙酸和丁酸等，乙酸參與脂肪生成和糖異生過程，丙酸可以影響肝臟和膽固醇代謝[4]，丁酸是腸道上皮細胞的重要能量來源[26]，異戊酸屬于支鏈脂肪酸，具有顯著的抗炎效果[27]。SCFAs含量可以作為評價腸道微生態(tài)平衡的重要指標。如圖2a所示，4種果蔬凍干粉對乙酸增加均有明顯的促進作用，其中桑葚組顯著高于對照和其它果蔬組（P＜0.05），在24 h達到最高值為465.41μg/mL。發(fā)酵24 h時，絲瓜粉組的丙酸含量達到122.35μg/mL，顯著高于其它果蔬組（P＜0.05），低于對照組（圖2b）。絲瓜粉組自發(fā)酵6h起促進丁酸含量增加，且顯著高于其它果蔬組（P＜0.05），12 h達到最大值為130.24μg/mL（圖2c）。各果蔬組處理的異戊酸含量均較低，僅絲瓜組有促進作用（圖2d）。

圖2 體外發(fā)酵各組（a）乙酸、（b）丙酸、（c）丁酸和（d）異戊酸的產(chǎn)量Fig.2 The production of（a）acetic acid，（b）propionic acid，（c）butyric acid and（d）iso-valeric acid in the in vitro fermentation system

3 結(jié)論與討論

體外模擬腸道微生態(tài)體系具有操作簡便、重現(xiàn)性好和成本經(jīng)濟等特點，能夠方便快捷地研究腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的變化。常見的體外發(fā)酵體系有人腸道模擬系統(tǒng)（SHIME）[10]、三聯(lián)體外發(fā)酵模擬系統(tǒng)[11]和迷你體外模擬腸道系統(tǒng)（Copenhagen MiniGut）[28]等。本研究基于體外模擬腸道微生態(tài)體系，分別評價了絲瓜、香菇、桑葚和枸杞凍干粉對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，結(jié)果表明，4種果蔬凍干粉均能夠不同程度增加有益菌數(shù)量和SCFAs含量，為今后篩選健康膳食干預、科學飲食搭配提供試驗參考。

果蔬中富含膳食纖維，膳食纖維尤其是不溶性膳食纖維能夠直接經(jīng)過胃、小腸部位進入腸道[29]。許多研究證明普氏菌屬和擬桿菌屬均可利用復雜碳水化合物產(chǎn)生乙酸和丙酸[24，30]，雙歧桿菌和乳酸桿菌是益生菌，可以維持免疫平衡和增強腸道屏障功能[22-23]，利用單糖或低聚糖代謝產(chǎn)生乙酸[2]。丁酸CoA可在乙酸存在的條件下通過butyryl CoA：acetate CoA轉(zhuǎn)移酶合成丁酸[31]。果蔬中的單糖可被雙歧桿菌和乳酸桿菌利用[32]，多酚可以選擇性地促進雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加[33]。本研究發(fā)現(xiàn)絲瓜能夠顯著促進普氏菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量及其代謝物乙酸、丙酸、丁酸含量（圖1-2）。絲瓜的總膳食纖維和總酚含量均較高（表2），推測絲瓜的膳食纖維可能促進普氏菌屬和擬桿菌屬直接代謝產(chǎn)生乙酸和丙酸，多酚及可溶性糖促進雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量增加，大量乙酸存在的環(huán)境促使丁酸CoA轉(zhuǎn)化為丁酸，這些使絲瓜呈現(xiàn)出明顯的益生元功效。本研究還發(fā)現(xiàn)桑葚粉的果糖和總酚含量最高，且對雙歧桿菌屬數(shù)量和乙酸含量的增加顯著高于其它果蔬組，乳酸桿菌數(shù)量增加顯著高于除絲瓜組以外的其它果蔬組。同樣的，枸杞粉的單糖和總酚含量相比桑葚粉含量較低，具有促進雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量和乙酸含量的增加效果，然而比桑葚組較弱，說明果蔬對有益菌數(shù)量和SCFAs產(chǎn)量的影響與營養(yǎng)成分含量有極大關(guān)系。阿克曼氏菌是黏液降解菌，特異性利用腸道中的黏蛋白，能夠改善腸道屏障功能。據(jù)報道是與降脂、降血糖等功能密切相關(guān)的有益菌種[25，34]。通過基因組測序發(fā)現(xiàn)該菌具有果糖和甘露糖代謝途徑[35]，然而目前尚缺研究證實。本研究顯示4種果蔬凍干粉均未能對阿克曼氏菌數(shù)量增加產(chǎn)生顯著性影響，這說明果蔬調(diào)節(jié)阿克曼氏菌的特殊性和復雜性。特定營養(yǎng)組分對阿克曼氏菌的調(diào)節(jié)機制，以及阿克曼氏菌與其它菌群的相互作用仍需進一步挖掘。

通過上述分析得出，本研究建立的體外模擬腸道微生態(tài)體系可以用來評價果蔬凍干粉的益生元功效，且研究發(fā)現(xiàn)絲瓜、桑葚和枸杞能夠促進腸道中4種有益菌生長和SCFAs產(chǎn)生，其中絲瓜和桑葚展示出顯著的益生元功效。針對這些果蔬中各個營養(yǎng)組分的益生元效果以及如何對人體腸道菌群起到益生作用還有待進一步研究。