紀冬梅，曹云霞

1978年世界首例體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）產(chǎn)生的“試管嬰兒”誕生以后，輔助生殖技術(shù)及其衍生的配子/胚胎顯微操作技術(shù)迅速發(fā)展成熟，與分子遺傳學(xué)的發(fā)展相結(jié)合促生的生殖遺傳技術(shù)包括胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）為許多遺傳性疾病的預(yù)防提供新思路、新方法。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）異?？蓪?dǎo)致嚴重的線粒體遺傳病，至今無法治愈。雖然PGT技術(shù)在世界范圍內(nèi)已經(jīng)廣泛開展用于預(yù)防染色體遺傳病或核基因組異常導(dǎo)致的遺傳病，但是線粒體遺傳病是否也可以借助PGT技術(shù)進行預(yù)防？生殖遺傳新技術(shù)即線粒體置換技術(shù)用于預(yù)防線粒體遺傳病是否更有價值呢？現(xiàn)對PGT、產(chǎn)前診斷及新型線粒體置換技術(shù)在預(yù)防、阻斷線粒體遺傳病中的研究進展進行綜述。

1 mtDNA與線粒體遺傳

線粒體是存在于真核細胞中的重要細胞器，其主要作用是通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量，被稱為細胞的“能量工廠”。線粒體含有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，是動物細胞內(nèi)唯一存在于細胞核外且含有遺傳物質(zhì)（即mtDNA）的細胞器。人類mtDNA是1個雙鏈環(huán)狀DNA，大小約16 569 bp，共編碼13條多肽鏈、22種tRNA和2種rRNA，13種蛋白質(zhì)均是呼吸鏈酶復(fù)合物與氧化磷酸化系統(tǒng)（oxidative phosphorylation system，OXPHOS）的亞單位，與核DNA（nDNA）編碼的1 145種蛋白質(zhì)共同維持氧化磷酸化的正常功能[1]，因此線粒體功能受到線粒體基因和核基因雙重控制。理解mtDNA的遺傳學(xué)特征對于了解mtDNA疾病至關(guān)重要，包括mtDNA基因組的多拷貝性質(zhì)、不同細胞類型含mtDNA分子數(shù)量不同。以人類配子為例，人類精子mtDNA拷貝數(shù)約100個，而成熟卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)約10萬～60萬個。mtDNA的特點之一是異質(zhì)性，即2種及2種以上類型mtDNA可共存于某一組織或細胞內(nèi)，而當某一組織或細胞內(nèi)只存在同一類型mtDNA基因組時，稱為同質(zhì)性。研究發(fā)現(xiàn)尿液中的突變mtDNA含量比血液和口腔黏膜中的突變mtDNA比例高，即異質(zhì)性更高，因此尿液更適于致病mtDNA的篩查[2]。重要的是，在含有致病性mtDNA突變的異質(zhì)性個體中，突變型與野生型mtDNA的比例決定了疾病的臨床表現(xiàn)，通常突變mtDNA負荷越高癥狀越嚴重。當mtDNA突變的水平達到或超過某個閾值時才表現(xiàn)臨床癥狀，這就是所謂的閾值效應(yīng)。閾值通常被認為是60%～80%的突變負荷，也可以根據(jù)具體的mtDNA突變不同而變化[3]，但某些疾病的發(fā)病閾值仍然未知。

mtDNA的另一個顯著特點是母系遺傳，即只有母親能將mtDNA傳遞給子代，也只有女兒能將致病的mtDNA繼續(xù)傳遞給下一代。在健康人群中沒有父系mtDNA基因型出現(xiàn)[4]，最有可能的原因是在受精后的卵母細胞內(nèi)有針對性破壞父系mtDNA的物質(zhì)[5]。在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂過程中，經(jīng)過復(fù)制新合成的mtDNA以隨機的方式分配到子細胞中，可導(dǎo)致子細胞中mtDNA異質(zhì)性發(fā)生改變，稱為復(fù)制分離（replicative segregation）。例如，在卵子發(fā)生過程中，mtDNA數(shù)目是不斷變化的，在胚胎發(fā)生和組織形成的細胞分裂過程中，線粒體的選擇、分配是隨機的。人成熟卵母細胞約含10萬個mtDNA，只有約100個mtDNA被隨機選擇遺傳給下一代，再經(jīng)過復(fù)制擴增構(gòu)成子代卵子的線粒體群。這種卵母細胞形成過程中mtDNA數(shù)量劇減過程稱為線粒體遺傳瓶頸（genetic bottleneck）。遺傳瓶頸與復(fù)制分離調(diào)控mtDNA遺傳的數(shù)量和種類，造成子代間個體顯著的差異，甚至單卵雙胎兒也可能表現(xiàn)為不同表型[6]。

2 線粒體遺傳病

其有廣義和狹義之分，廣義的線粒體遺傳病是指由mtDNA、nDNA突變等遺傳缺陷導(dǎo)致線粒體內(nèi)酶或蛋白質(zhì)缺陷，最終導(dǎo)致細胞功能損傷和臨床癥狀甚至綜合征，發(fā)病率約為1/10 000～1/5 000；狹義的線粒體遺傳病是指mtDNA突變導(dǎo)致的母源性遺傳病，通常所指線粒體遺傳病即為狹義的線粒體遺傳病。卵子的mtDNA突變通過母親傳遞給子代，可引起母系家族性疾病，而生殖細胞核基因組上編碼線粒體功能蛋白的基因突變也會遺傳給子代，但是遺傳方式并不確定，多為伴X連鎖遺傳。近年來，mtDNA突變與線粒體遺傳病的研究備受關(guān)注。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種與mtDNA突變有關(guān)的人類線粒體遺傳病。線粒體遺傳病多數(shù)是由mtDNA突變所致，mtDNA突變包括點突變、堿基缺失、重復(fù)以及mtDNA大片段的丟失等。輔助生殖門診最常見的線粒體遺傳病患者為線粒體腦肌病，主要包括Leigh’s綜合征（LS）和線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征（mitochondrial encephalomyopathy with lactic academia and stroke-like episodes，MELAS），可能由于線粒體腦肌病發(fā)病早，患兒母親尚有生育能力才會求助生殖門診。LS好發(fā)于嬰幼兒，首發(fā)癥狀主要表現(xiàn)為運動異常、眼部癥狀和癲癇發(fā)作，其特點是在磁共振成像下可見大腦壞死病灶，尤其是在中腦和腦干。LS具有年齡依賴性，呼吸鏈酶復(fù)合物基因變異是LS最常見原因，其中以SURF1突變最多，其次為m.8993 T＞C/G、m.14487 T＞C與m.13513 G＞A[7]，還有少見的m.11777 C＞A[8]，m.10191 T＞C[9]。MELAS典型發(fā)病年齡在2～15歲之間，也可能發(fā)生在嬰兒期或成年；臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，最初的癥狀可能表現(xiàn)為類似中風(fēng)發(fā)作、癲癇、偏頭痛、反復(fù)嘔吐。類似中風(fēng)發(fā)作伴有癲癇是MELAS的典型癥狀，可導(dǎo)致部分癱瘓、失明、局部神經(jīng)缺陷，長期反復(fù)發(fā)作最終導(dǎo)致喪失運動功能、視力下降、身體的感覺功能丟失以及精神障礙如癡呆。MELAS患者的血液與腦脊液中常出現(xiàn)高水平乳酸堆積。MELAS表現(xiàn)為母源性遺傳，由于mtDNA的缺陷引起，目前發(fā)現(xiàn)至少有17個不同的mtDNA突變會導(dǎo)致MELAS，最常見的是m.DNA3243 A＞G突變[10-11]。

到目前為止，線粒體遺傳病無法治愈，只能依賴于緩解癥狀以及延緩病情進展的輔助治療，因此預(yù)防顯得更為重要。然而由于mtDNA的“遺傳瓶頸”和“復(fù)制分離”等特征，即使攜帶低水平突變mtDNA的無癥狀攜帶者仍可能產(chǎn)生具有高突變負荷的卵母細胞從而使子代患病，此外，導(dǎo)致器官功能障礙和臨床疾病表達的關(guān)鍵突變mtDNA閾值存在差異，因此，攜帶致病性mtDNA突變女性的生育遺傳咨詢非常具有挑戰(zhàn)性，特別是低突變負荷的無癥狀攜帶者可以產(chǎn)生具有高突變負荷的卵母細胞。事實上，由于其后代中mtDNA異質(zhì)性水平顯著不同，攜帶致病性mtDNA突變婦女的遺傳咨詢進一步復(fù)雜化。

3 線粒體遺傳病的產(chǎn)前診斷和PGT

目前用于預(yù)防線粒體遺傳病的常規(guī)方法有產(chǎn)前診斷和PGT。產(chǎn)前診斷是一種在早期妊娠不同階段對細胞進行采樣的技術(shù)，突變mtDNA水平高時可選擇終止妊娠，可降低子代患嚴重線粒體遺傳病的風(fēng)險[12]。線粒體遺傳病具有很高的臨床變異性，主要是由組織間突變負荷的變化所導(dǎo)致的。這種由于組織間變異性以及取樣時胎兒發(fā)育階段不同導(dǎo)致的mtDNA突變負荷差異使得產(chǎn)前診斷存在一定的風(fēng)險。最新的研究發(fā)現(xiàn)當整個胎盤水平的平均突變負荷較低（＜20%）或較高（＞80%）時，不同部位樣本的異質(zhì)性分布是均勻的；反之，總體異質(zhì)性在中等水平（20%～80%）時，突變負荷越接近40%～50%，異質(zhì)性差異越顯著，可高達43%，并且分布越廣。羊膜細胞的mtDNA突變水平和臍帶血細胞相似，但是與胎盤樣本不同。因此，測定絨毛的突變mtDNA水平對某些線粒體遺傳病進行產(chǎn)前診斷應(yīng)謹慎，最好同時測定羊膜細胞mtDNA突變水平[13]。目前情況下，要想確定一個產(chǎn)前診斷的安全閾值，并確保該閾值之下的子代以后不會患線粒體遺傳病，幾乎不可能。而且產(chǎn)前診斷對于高水平突變mtDNA胎兒要進行引產(chǎn)終止妊娠，對孕婦和家庭傷害較大。

建立在IVF-ET基礎(chǔ)上的PGT技術(shù)是指從早期胚胎中取出一個或多個細胞進行基因檢測，選擇無突變或低突變負荷的胚胎移植到子宮，逐漸被用于減少線粒體遺傳病的風(fēng)險[14]。2006年，Steffann等[15]報道了首例用卵裂球活檢PGT技術(shù)篩選胚胎預(yù)防線粒體遺傳病傳遞獲得健康子代的成功案例，之后又有研究利用PGT技術(shù)預(yù)防特異性mtDNA突變，從而獲得健康子代[16-19]。PGT涉及的胚胎活檢主要包括卵裂期胚胎的卵裂球活檢、囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢和極體活檢等。研究發(fā)現(xiàn)2種mtDNA比例在成熟卵母細胞的卵胞質(zhì)vs.極體、以及每個2-細胞、4-細胞、6-細胞和（或）8-細胞胚胎的卵裂球間的分布幾乎是相同的，因此活檢極體或卵裂球檢測mtDNA異質(zhì)性可以代表整個胚胎，但是極體活檢結(jié)合卵裂球活檢行PGT更為可靠[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)活檢不同階段卵子或胚胎樣本進行遺傳學(xué)檢測的可靠性不一致，滋養(yǎng)外胚層細胞mtDNA的異質(zhì)性水平比第二極體更為接近胚胎干細胞的mtDNA異質(zhì)性水平[21]，與卵裂期活檢相比，滋養(yǎng)外胚層活檢能夠提高準確度而不降低胚胎發(fā)育潛能。近期一項研究認為單卵裂球活檢PGT方案診斷m.3243A＞G突變錯誤率很低（0.34%）；鑒于植入前的早期胚胎中幾乎不發(fā)生mtDNA復(fù)制[22]，并且mtDNA在子細胞中隨機分布，因此認為這一結(jié)果與特定mtDNA突變無關(guān)，適用于所有mtDNA突變[23]。第1例胚胎活檢移植了含有12%mtDNA突變負荷的胚胎，出生嬰兒不同組織的突變負荷不到15%[16]。但另有對6周齡和18個月齡兒童的再分析顯示，mtDNA突變負荷分別為42%和52%，并且該兒童患有復(fù)雜的神經(jīng)性和多系統(tǒng)問題，但不是與m.3243A＞G相關(guān)的典型線粒體遺傳病。

以上結(jié)果證實了PGT可以幫助選擇突變mtDNA水平低的胚胎進行移植，是降低攜帶致病mtDNA突變女性后代患線粒體遺傳病風(fēng)險的可行選擇。然而，到目前為止仍無法確定PGT用于預(yù)防線粒體遺傳病的安全閾值，推測其他因素包括細胞核因素也可能起關(guān)鍵作用。此外，PGT并不是萬能的，不適于只產(chǎn)生攜帶高水平突變mtDNA卵子/胚胎的患者。該問題突出了對可降低線粒體遺傳病遺傳風(fēng)險的新型技術(shù)的需要，建立在核移植基礎(chǔ)上健康線粒體捐贈技術(shù)為降低線粒體遺傳病的傳遞風(fēng)險帶來希望。

4 線粒體置換技術(shù)在線粒體遺傳病的應(yīng)用價值及其局限性

mtDNA的母系遺傳決定了突變的mtDNA只通過卵母細胞遺傳給子代，那么如果能夠減少卵子傳遞的突變線粒體、增加功能正常線粒體或者用健康的線粒體替換突變的線粒體，是不是可以有效減少甚至阻斷突變mtDNA的遺傳？基于細胞核移植基礎(chǔ)上的線粒體置換減少卵子/胚胎中異常線粒體比例的線粒體捐贈（mitochondria donation）技術(shù)可有效減少致病mtDNA從母親傳遞給子代，從而避免線粒體遺傳病的子代出生，為線粒體遺傳病的預(yù)防開辟了新天地。線粒體捐贈技術(shù)是基于核物質(zhì)移植的生殖遺傳技術(shù)，指用健康的線粒體替換線粒體遺傳病患者或攜帶者的突變線粒體的方法，所誕生的子代常被稱為“三親”試管嬰兒，即具有父母雙親的核遺傳物質(zhì)，又有第三方線粒體捐贈者的mtDNA。

迄今為止，各國科學(xué)家先后發(fā)明4種線粒體置換技術(shù)，是將線粒體遺傳病患者卵子/受精卵的紡錘體-染色體復(fù)合物、第一極體、原核、第二極體等核物質(zhì)移植到正常女性的去核卵/受精胞質(zhì)中，獲得的健康卵子與患者丈夫精子結(jié)合獲得健康的胚胎，從而降低了后代患嚴重線粒體遺傳病的風(fēng)險。線粒體置換技術(shù)主要包括原核移植（pronuclear transfer，PNT）[24-25]、紡錘體-染色體復(fù)合物移植（spindle-complex transfer，ST）[26]、第一極體移植（firstpolar bodytransfer，PB1T）[27-29]、第二極體移植（second polar body transfer，PB2T）[26-27]等。PNT和ST是迄今為止研究最多的，有越來越多的科學(xué)數(shù)據(jù)證實這些核移植技術(shù)有預(yù)防線粒體遺傳病的潛力。2016年英國國會已經(jīng)通過立法，首先將ST與PNT技術(shù)用于預(yù)防嚴重線粒體遺傳病的向子代傳遞。目前有研究報道了世界首例ST來源的“三親嬰兒”誕生[30]。該案例中攜帶m.8993T＞G致病mtDNA突變的女性經(jīng)歷了4次不明原因性流產(chǎn)，出生的2個孩子均死于高水平母系遺傳的mtDNA變異導(dǎo)致的LS，該患者夫婦接受了紡錘體移植技術(shù)，選擇了平均突變負荷為5.73%的ST男性胚胎進行移植，胎兒出生后多個組織平均mtDNA異質(zhì)性水平是2.36%～9.23%，生后7個月時表現(xiàn)健康[30]。以上結(jié)果表明ST能有效地減少致病mtDNA突變的遺傳，并且ST囊胚能正常發(fā)育、著床、產(chǎn)生子代。雖然ST能顯著減少致病mtDNA的異質(zhì)性，但仍可能會導(dǎo)致一定量的突變mtDNA殘留，盡管在新生兒組織中報道的mtDNA殘留量很低，仍不清楚突變的mtDNA是否會在不同組織中積累甚至發(fā)生mtDNA單倍型逆轉(zhuǎn)，因此長期追蹤隨訪出生子代健康對于評估線粒體置換的安全性和有效性極為重要。

雖然英國已經(jīng)通過立法允許ST與PNT技術(shù)用于預(yù)防嚴重的線粒體遺傳病向子代傳遞，但是線粒體置換技術(shù)的臨床應(yīng)用未能在國際上普遍獲得立法。線粒體置換技術(shù)難以廣泛應(yīng)用于臨床的核心問題是線粒體置換的安全性與“三親嬰兒”涉及的倫理問題。首先，線粒體置換技術(shù)涉及“核移植”，是否會像眾所周知的體細胞核移植即“克隆”技術(shù)存在效率低、移植后流產(chǎn)率高、克隆動物壽命短死亡率高等嚴重的不良結(jié)局[31-33]？雖然極體基因組移植與體細胞核移植操作過程相似，但存在本質(zhì)上的區(qū)別，線粒體置換是生殖細胞的核移植，生殖細胞不需要將一個已分化、高甲基化水平的體細胞重新編程恢復(fù)全能性，目前的研究未發(fā)現(xiàn)存在線粒體置換子代或胚胎干細胞存在遺傳和表觀遺傳的異常[24-29]，但是長期安全性有待進一步研究。其次，社會各界擔憂線粒體置換技術(shù)雖然使疾病線粒體的比例得到顯著降低，但殘余存在的少量致病mtDNA突變會不會繼續(xù)復(fù)制擴增從而導(dǎo)致在子代中“復(fù)發(fā)”？目前公開發(fā)表的研究發(fā)現(xiàn)線粒體置換重構(gòu)胚中即使攜帶極少量致病mtDNA殘留都可能存在很大的潛在風(fēng)險，即殘留的突變型mtDNA復(fù)制、擴增的速率可能遠超健康mtDNA，最終致病mtDNA的比例逐漸上升占主導(dǎo)地位，甚至發(fā)生mtDNA基因型完全逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致線粒體遺傳病再發(fā)[34-35]。這種現(xiàn)象亦被稱為mtDNA單倍型漂移，具體的發(fā)生機制尚不清楚。最新的研究從12 975個個體（其中包含1 526對母子）中獲得了高分辨率的異質(zhì)性變異圖譜，分析mtDNA異質(zhì)性特征與nDNA的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)微量的mtDNA能夠轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，結(jié)果表明在具有不同線粒體與核祖先的人群中，最近的線粒體突變更傾向于在具有相同核祖先的群體中出現(xiàn)，而不是相同的線粒體祖先，這些結(jié)果表明細胞內(nèi)mtDNA的變化可能是由nDNA決定的[36]。該研究為“線粒體置換治療”選擇健康線粒體捐贈者時進行mtDNA與nDNA的配型需求提供依據(jù)，以防止長期發(fā)育傳代過程中的潛在健康問題。首例“三親嬰兒”誕生以后，引起醫(yī)學(xué)大量倫理爭議，支持者認為該技術(shù)能夠挽救無數(shù)的患者和家庭；批評者認為這是不負責任、不符合倫理的行為，主要原因為該技術(shù)長期的、潛在的風(fēng)險還不得而知[37]。那么，如何使線粒體捐贈者及受贈者、社會等認可并支持這一新興技術(shù)用于阻斷線粒體遺傳病？仍需進一步深入研究，獲得大量的線粒體置換基礎(chǔ)研究與臨床試驗的安全性數(shù)據(jù)支持，經(jīng)過國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的專家進行全面的可行性論證，結(jié)合對社會各界進行深入調(diào)研、討論、征詢，最終形成草案等，推動該技術(shù)在我國的立法，走進臨床，造?；颊摺?/p>

5 結(jié)語與展望

綜上，線粒體遺傳病女性患者的生育選擇首先要先進行生育力評估與遺傳咨詢，對于卵巢功能低下的患者可選擇領(lǐng)養(yǎng)孩子或接受供卵IVF-ET技術(shù)；對于可以產(chǎn)生攜帶低水平突變mtDNA胚胎的患者可以選擇PGT結(jié)合產(chǎn)前診斷技術(shù)進行預(yù)防，極體檢測結(jié)合卵裂球或者滋養(yǎng)外胚層檢測可提高PGT的準確性。在我國尚未立法允許健康線粒體置換應(yīng)用于嚴重線粒體遺傳病情況下，有必要開展PGT與產(chǎn)前診斷技術(shù)預(yù)防線粒體遺傳病的臨床研究，建立臨床上可行的線粒體遺傳病的植入前與產(chǎn)前篩查技術(shù)體系，從而早日幫助線粒體遺傳病患者獲得健康子代。對于卵巢功能較好而只產(chǎn)生高水平mtDNA突變胚胎的線粒體遺傳病患者，可以借助線粒體捐贈技術(shù)獲得健康子代。但是線粒體置換技術(shù)臨床應(yīng)用前研究任重而道遠，有必要在動物模型個體以及人胚胎干細胞水平深度解析線粒體置換重構(gòu)胚中殘留mtDNA的去向與長期穩(wěn)定性，探索異源線粒體共存時線粒體漂移的發(fā)生機制及應(yīng)對措施，不斷提高與完善線粒體置換技術(shù)安全性與有效性，才能推動該技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化。