馮暄，張慶華，張釧，郝勝菊，鄭雷，王興

Pallister-Killian綜合征（Pallister-Killian syndrome，PKS，OMIM 601803）的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟缺損、膈疝、低張力、癲癇和皮膚色素異常。1977年，Pallister等[1]在成人中首次描述了這種病。雖然發(fā)病率尚不清楚，但醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了100多例PKS，隨著產(chǎn)婦年齡的增加，PKS的發(fā)病率也隨之增加[2]。PKS的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)是特定組織中以嵌合體形式存在的12號(hào)短臂等臂染色體，故也稱(chēng)為等臂12p綜合征或12p四體綜合征。這些異常細(xì)胞由4個(gè)12號(hào)短臂染色體組成，而不是正常存在的2個(gè)染色體。12p四體的嵌合效應(yīng)是由于額外染色體上攜帶的基因，最終導(dǎo)致顱面部、心血管、腎臟和其他系統(tǒng)異常。

1 病例報(bào)告

孕婦27歲，孕2產(chǎn)1，否認(rèn)近親婚配，且無(wú)遺傳病家族史。未做產(chǎn)前篩查，妊娠中期四維彩色超聲提示：胎兒膈疝可能性大，主/肺動(dòng)脈比例不協(xié)調(diào)。經(jīng)過(guò)產(chǎn)科醫(yī)生咨詢，簽署知情同意書(shū)后，于孕24周行羊水穿刺，抽取孕婦羊水30 mL，取其中10 mL用于高通量測(cè)序拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variation sequencing，CNV-seq）檢測(cè)。其余20 mL羊水分2管，經(jīng)離心機(jī)（Eppendorf 5804R）2 000 r/min離心10 min后棄上清，取沉淀細(xì)胞，加適量羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8～9 d，后進(jìn)行消化、染色體制片、G顯帶及核型分析。以G顯帶染色制備染色體標(biāo)本。按照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（2013）標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)核型。胎兒羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果：47，XY，＋i（12）（p10）[58]/46,XX[42]，說(shuō)明該樣本為12號(hào)短臂等臂染色體的嵌合體，見(jiàn)圖1。

圖1 胎兒羊水培養(yǎng)染色體核型圖

高通量測(cè)序CNV-seq法提取羊水基因組DNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建：通過(guò)片段化－連接、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）前純化、PCR擴(kuò)增、PCR后純化一系列過(guò)程，利用Next Seq CN500高通量測(cè)序平臺(tái)行CNV-seq檢測(cè)，并進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果經(jīng)貝瑞基因Enliven?變異注釋系統(tǒng)標(biāo)注。CNV-seq結(jié)果提示：du p（12）（p13．33p11．1）（mos），提示該樣本12號(hào)染色體p13.33-p11.1處檢測(cè)到拷貝數(shù)為3.5、片段大小為34.70 Mb的嵌合重復(fù)區(qū)域，起始位置為chr12:160001-34860000，見(jiàn)圖2，3。查閱Decipher數(shù)據(jù)庫(kù)（Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource）、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)和UCSC Genome Browser（University of California Santa Cruz），該變異包含了Pallister-Killian syndrome（PKS）[OMIM:601803]的全部區(qū)域。數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，PKS患者主要表現(xiàn)為不同程度的智力障礙和發(fā)育遲緩，特殊面容，毛發(fā)稀疏，皮膚著色異常，耳聾，癲癇，脊柱側(cè)彎，先天性髖關(guān)節(jié)脫位，指/趾畸形，新生兒肌張力減退，膈疝，先天性心臟缺陷，肺部發(fā)育不良，腎臟發(fā)育不良，喂養(yǎng)困難，腸旋轉(zhuǎn)不良，肛門(mén)異常，腹股溝疝，男性外生殖器異常等。結(jié)合羊水染色體核型分析與CNV-seq結(jié)果，該樣本確診為PKS。為明確變異來(lái)源，召回孕婦及其丈夫，進(jìn)行外周血染色體核型分析。夫妻雙方G顯帶核型結(jié)果均未見(jiàn)異常，見(jiàn)圖4，說(shuō)明胎兒的染色體異常為新發(fā)。

2 討論

圖2 孕婦及丈夫外周血染色體核型圖

圖3 胎兒CNV-seq檢測(cè)12號(hào)染色體測(cè)序散點(diǎn)圖

圖4 胎兒cnv-seq檢測(cè)12號(hào)染色體拷貝數(shù)變異圖示

PKS可能涉及體內(nèi)的任何器官系統(tǒng)。雖然沒(méi)有可以作為PKS臨床診斷的典型畸形表現(xiàn)，但依然存在著很明顯的臨床特征：①特殊面容，皮膚色素異常、粗獷面容、眼距寬、高腭弓、前額突出、短頸等；②神經(jīng)系統(tǒng)：腦結(jié)構(gòu)異常、癲癇、肌張力減退；③心臟缺陷：房間隔缺損；④肺部受累：肺發(fā)育不全、膈疝；⑤胃腸道表現(xiàn)可能包括腸旋轉(zhuǎn)不良和肛門(mén)移位；⑥骨骼肌肉系統(tǒng)發(fā)育異常，包括PKS特有的生長(zhǎng)模式，即在宮內(nèi)提示明顯的生長(zhǎng)過(guò)度現(xiàn)象，但在出生后立即表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩；75%的PKS患者還患有一定程度的視力損傷[3]。先天性膈疝被認(rèn)為是PKS典型的特征，并且經(jīng)常是出生后早期的死亡原因[4]。PKS在妊娠中期超聲中可顯示明顯的畸形，常見(jiàn)的畸形包括：羊水過(guò)多、膈疝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、胎兒水腫、顏面部異常、心室擴(kuò)張、短肢畸形；當(dāng)超聲提示羊水過(guò)多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生長(zhǎng)過(guò)度時(shí)，尤其應(yīng)考慮本病[5]。本病例中的孕婦，妊娠中期系統(tǒng)超聲提示：胎兒先天性膈疝，股骨、肱骨位于平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以下、心臟移位至右側(cè)胸腔、肺/主動(dòng)脈比值增大、心包積液、三尖瓣返流（少量）。符合PKS超聲指標(biāo)的主要特征。

PKS是一種散發(fā)的，罕見(jiàn)的染色體疾病，具有復(fù)雜的臨床表型及特殊的遺傳學(xué)特點(diǎn)，臨床上往往容易漏診，所以準(zhǔn)確有效的產(chǎn)前診斷，是避免缺陷患兒出生、減輕患兒家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)的最佳手段。在產(chǎn)前診斷中，超聲檢查對(duì)PKS的診斷具有重要價(jià)值，當(dāng)碰到羊水過(guò)大、先天性膈疝、四肢短小、過(guò)度發(fā)育的胎兒應(yīng)該高度警惕，隨著三維超聲技術(shù)的發(fā)展，胎兒面部特點(diǎn)的三維成像也能為PKS產(chǎn)前診斷提供更多的信息；當(dāng)在臨床中遇到特征性的粗獷面容（大前額、頭發(fā)稀疏、眼間距增寬、短鼻且鼻孔前傾、鼻梁低平、人中長(zhǎng)、頸短），重度發(fā)育遲緩、皮膚色素異常等癥狀時(shí)，臨床醫(yī)師可提出初步判斷，并且應(yīng)注意不同組織來(lái)源標(biāo)本的特點(diǎn)，并結(jié)合多種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行診斷。盡管PKS真實(shí)的發(fā)病率不能確定，但其是一種很罕見(jiàn)的遺傳病，因?yàn)榘Y狀相對(duì)較輕的此病患兒可能會(huì)被人們忽視，所以某些患者事實(shí)上并未在醫(yī)院留有確診記錄。因此，被確診的病例僅僅是此病癥狀相對(duì)嚴(yán)重的一些患兒。在已有的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記錄中，僅有150多例PKS的確診病例。正是由于PKS具有特殊的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)，即異常的染色體有組織特異性，在臨床中診斷可能常會(huì)被遺漏，所以遺傳咨詢就顯得更為重要。特別是對(duì)已經(jīng)生過(guò)PKS患兒的家庭，產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢是杜絕此類(lèi)患兒再次出生的唯一手段。首先，從遺傳模式來(lái)講，PKS不具有遺傳性。誘發(fā)此病的染色體變異一般是屬于父源或母源生殖細(xì)胞（精子或卵子）形成過(guò)程中發(fā)生的不確定事件。通常患者其他家庭成員都并沒(méi)有此病癥的患病史。細(xì)胞分裂中的反常現(xiàn)象，醫(yī)學(xué)上常稱(chēng)其為黏合現(xiàn)象，很可能會(huì)在某個(gè)生殖細(xì)胞中產(chǎn)生多余的12號(hào)短臂等臂染色體。如果此反常的生殖細(xì)胞影響到了下一代體內(nèi)細(xì)胞的基因組合，那么該新生兒體內(nèi)細(xì)胞可能會(huì)兼有12號(hào)染色體的兩份正?？截惡投嘤嗟?2號(hào)短臂等臂染色體。在胎兒的早期發(fā)育過(guò)程中，其體內(nèi)某些細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有多余的父源或母源12號(hào)短臂等臂染色體，而另一些細(xì)胞內(nèi)卻有。此遺傳現(xiàn)象在醫(yī)學(xué)上被稱(chēng)為染色體嵌合。幾乎所有的PKS都是由于此染色體嵌合現(xiàn)象引發(fā)的。如果所有的機(jī)體細(xì)胞里都有此多余的等臂染色體的話，那么引發(fā)的PKS癥狀的嚴(yán)重程度會(huì)使患者的生存質(zhì)量大為降低。

隨著二胎政策的全面放開(kāi)，高齡孕婦不斷增加，現(xiàn)行產(chǎn)前診斷技術(shù)核型分析不能滿足臨床產(chǎn)前診斷需求，鑒于CNV-seq在臨床的不斷實(shí)踐，其憑借著檢測(cè)范圍廣、精準(zhǔn)、通量高、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用逐步深入。2019年4月10日，國(guó)內(nèi)首個(gè)《低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》（簡(jiǎn)稱(chēng)《共識(shí)》）在《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》上刊發(fā)?！豆沧R(shí)》對(duì)CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用規(guī)范進(jìn)行了詳細(xì)的闡述說(shuō)明，對(duì)規(guī)范CNV-seq技術(shù)的臨床應(yīng)用，推動(dòng)技術(shù)發(fā)展起到了非常重要的作用。本病例用CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前明確診斷出PKS，也進(jìn)一步證實(shí)了CNV-seq技術(shù)作為一線技術(shù)應(yīng)用在臨床的效果，真實(shí)有效地評(píng)價(jià)了該技術(shù)的診斷水平。

本病例妊娠中期超聲提示先天性膈疝、股骨短等異常，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。運(yùn)用染色體G顯帶核型分析和CNV-seq技術(shù)檢測(cè)。羊水核型最初發(fā)現(xiàn)該樣本核型以嵌合形式存在1條額外標(biāo)記染色體，核型結(jié)果為47，X Y，+mar[58]/46，X Y[42]。與CNV-seq結(jié)果核對(duì)之后，可以明確這條額外標(biāo)記染色體的來(lái)源為12號(hào)染色體短臂，最終確定了羊水核型分析結(jié)果：47，X Y，+i（12）（p10）[58]/46，X Y[42]。這也證明了CNV-seq技術(shù)可以鑒別來(lái)源不明的胎兒標(biāo)記染色體，明確其遺傳物質(zhì)的來(lái)源，對(duì)染色體微缺失/微重復(fù)綜合征的診斷有重要價(jià)值。PKS患者異常的染色體有組織特異性，通常在皮膚成纖維細(xì)胞中可以檢測(cè)到異常。因此，由于PKS這種特殊的組織特異性，PKS的診斷可能經(jīng)常被遺漏，并且通常在快速分裂的細(xì)胞，如外周血淋巴細(xì)胞中未檢測(cè)到[6-7]?，F(xiàn)已報(bào)道的病例中幾乎沒(méi)有在外周淋巴細(xì)胞中診斷出異染色體i（12）（p10）的報(bào)道[8]。據(jù)不同組織中期染色體核型分析統(tǒng)計(jì)，包含異常染色體i（12）（p10）的組織中，淋巴細(xì)胞檢出率為0～2%，成纖維細(xì)胞檢出率為50%～100%，羊水細(xì)胞和骨髓細(xì)胞檢出率為100%[9]。本病例羊水細(xì)胞中i（12）（p10）占58%，羊水CNV-seq結(jié)果示12號(hào)染色體短臂重復(fù)，拷貝數(shù)為3.5，一般來(lái)說(shuō)，單純的染色體重復(fù)，檢測(cè)到的拷貝數(shù)應(yīng)為3，但該樣本是12號(hào)短臂等臂四倍體的嵌合體，導(dǎo)致其拷貝數(shù)為3.5。說(shuō)明CNV-seq技術(shù)可以精準(zhǔn)地檢測(cè)出比例高于5%的嵌合體。綜上所述，G顯帶核型分析與CNV-seq技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，可以明確診斷PKS。