劉洋，姚睿智，史宏昭，劉鵬，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

ICR 小鼠多被應用于生命科學、神經(jīng)科學、生理心理學和神經(jīng)精神藥物學等研究領域，使用廣泛[1]。特別是因其獨有生理特征得到了學者們的關注和認可，成已經(jīng)為了情緒障礙、感覺運動和認知功能這三大類神經(jīng)行為學研究中的主流試驗動物[2]，地位無可取代。但神經(jīng)行為學測試對試驗環(huán)境、測試條件和操作程序及受試動物體況等因素有著較為嚴格的要求，一旦對這些敏感因素把控不嚴，會給試驗結果造成不可估量的影響，這也嚴重阻礙了研究人員間的相互比較、參考。因此，研究選取了兩個個可互相印證、結果一致性的曠場試驗（open field test，OFT）和高架十字迷宮試驗（plus maze test，PMT）來測定ICR小鼠的相關神經(jīng)行為學指標，探討ICR 小鼠的行為特征，確立其參考范圍，為自發(fā)運動、探索行為和焦慮情緒的進一步研究奠定堅實的基礎，為今后的運動能力和情緒障礙這兩大方面神經(jīng)行為學研究提供有價值的參考，為神經(jīng)行為學研究中異常數(shù)值的篩選和剔除提供合理的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心的8 周齡的ICR 小鼠200 只（雌雄各半）。小鼠在人工智能氣候室中進行為期7 d 的適應性飼養(yǎng)，環(huán)境溫度設定為28±0.5 ℃，濕度為（40±5）%，自由采食、飲水。每5 只同性別ICR 小鼠群養(yǎng)于聚苯乙烯標準鼠籠中[鼠籠大小為375 mm（長）×173 mm（寬）×165 mm（高）]。每籠給予200 g 的松軟木屑墊料，每周更換墊料2 次。日光燈照明，光照強度為200 Lux，明暗周期比為12 L∶12 D（開燈8:00 am，關燈8:00 pm）。

適應性飼養(yǎng)完成后，觀察ICR 小鼠的健康狀況并篩選和剔除提出異常、發(fā)情小鼠，將在最終獲得ICR 小鼠分別用于曠場試驗、高架十字迷宮試驗（各神經(jīng)行為學測試裝置說明、操作方法、記錄指標將在下面詳細介紹，n=90，雌雄各半）。

1.1 實驗儀器與裝置

試驗中所用的TM-Vision 行為學試驗視頻分析系統(tǒng)、OFT-100 曠場試驗箱、PMT-100 高架十字迷宮和落地式試驗站等主要儀器均購自于成都泰盟軟件有限公司。

落地式試驗站相對獨立于外界環(huán)境，可減少行為學實驗因環(huán)境、燈光、氣流、噪音、人為干擾等的影響，因此所有的行為學測試全程均在落地式試驗站中進行。其頂部兩側裝有2 盞40 W 的日光燈作為照明系統(tǒng)，以保持觀察箱內的光照條件一致；箱頂正中固定一個與TM-Vision 行為學試驗視頻分析系統(tǒng)連接的高清攝像頭，用以收集并記錄圖像、試驗進程。

1.2.1 曠場試驗裝置

曠場試驗箱外形尺寸為625 mm（L）× 740 mm（W）× 510 mm（H），正面外側配有反光鏡，底壁及四周側壁由黑色塑膠構成（圖1 A）。

圖1 曠場試驗裝置Fig.1 Open-field test device

1.2.2 高架十字迷宮裝置

高架十字迷宮是由2 個開臂 [300 mm（長）×60 mm（寬）× 6 mm（高）]，2 個閉合臂[300 mm（長）×60 mm（寬）× 150 mm（高）]和1 個中心區(qū)域[60 mm（長）× 60 mm（寬）]組成，迷宮高度為500 mm，迷宮和閉臂側壁均是由黑色塑膠構成（圖2 A）。

1.3 測定程序

適應性飼養(yǎng)期間，實驗員每天抓摸小鼠10 min，使其適應試驗人員的捕捉操作，避免試驗時產(chǎn)生應激。實驗開始前30 min 將小鼠移入測試室適應，以減少新異環(huán)境刺激對小鼠活動的影響，保證試驗時小鼠活動趨于穩(wěn)定。各組均在上午（8:00～11:00）依次完成相應的神經(jīng)行為學測試。每只小鼠僅測試1 次，不再重復測定。試驗過程中嚴格控制環(huán)境因素，確保一致；保持測試室內安靜，試驗人員不可更換，不可使用香水或其他有刺激性氣味的物品。每次測試結束，清理糞便，徹底清洗試驗裝置底部和側壁，噴灑75%酒精，同時打開通氣，直至試驗裝置及落地試驗站內干燥無異味后再進行下一只小鼠的測試，避免前次受試小鼠的殘留氣味影響下一次的試驗。

圖2 高架十字迷宮裝置Fig.2 Plus maze test device

1.3.1 曠場試驗測試

打開OFT-100 曠場試驗視頻分析系統(tǒng)，設置試驗各項數(shù)據(jù)（如試驗人員、項目名稱和簡述等），同時將單次測試總時間設為300 s，數(shù)據(jù)顯示間隔設為3 s；打開攝像頭，調節(jié)光線亮度與試驗箱的位置。進行區(qū)域設定，選擇25 宮格模式，確定站立區(qū)和中心區(qū)域比例（見圖1 B）；最終設定標尺。設置完成后，點擊“開始試驗”，填寫動物編號、溫度、濕度等試驗參數(shù)。而后將ICR 小鼠背對試驗人員放入曠試驗箱中央，點擊“確定”命令，即可通過視頻行為分析系統(tǒng)觀察和記錄受試小鼠在曠場試驗箱內5 min 的活動情況，觀察、記錄指標包括：運動距離、靜止時間、運動時間、區(qū)域分布指標（四邊、四角、中央的活動情況）、站立次數(shù)、運動軌跡等。

1.3.2 高架十字迷宮測試

除區(qū)域設定出2 條開臂和2 條閉臂（依次編號為1、2、3、4）以及中心區(qū)域（編號為5）外（見圖2 B），PMT-100 系列十字迷宮視頻分析系統(tǒng)試驗操作程序大體同上。受試小鼠放置于中間區(qū)域（面向開臂），點擊“確定”命令，即可通過視頻行為分析系統(tǒng)觀察和記錄受試小鼠在高架十字迷宮內5 min 的活動情況，觀察、記錄指標包括：運動距離、靜止時間、運動時間、區(qū)域分布指標（開臂、閉臂、中央的活動情況）、開臂進入次數(shù)、運動軌跡等。

1.4 統(tǒng)計處理

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism（La Jolla，CA，USA）軟件進行分析，并作圖，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤（x±SEM）表示，比較分析用One-way ANOVA分析方法，P<0.05 有統(tǒng)計學意義。

圖3 曠場試驗中小鼠活動軌跡圖Fig.3 Mouse activity of trajectory map in open field test

2 結果

2.1 ICR 小鼠曠場試驗測試結果

在這里我們展示了ICR 小鼠在曠場試驗中的運動軌跡，以便更加直觀地表現(xiàn)出小鼠的運動和區(qū)域分布狀態(tài)。因篇幅的原因并未全部列出，但這些圖片具有較好的普遍性和代表性，見圖3。

曠場試驗中各項指標的測試結果及其95%置信區(qū)間見表1。

ICR 小鼠在曠場試驗中的性別差異如圖4 所示，雌、雄ICR 小鼠在運動時間、靜止時間、各區(qū)域滯留時間、運動距離和站立次數(shù)等指標中均無明顯差異。

表1 ICR 小鼠開場實驗測定結果及95%置信區(qū)間Table 1 Open-field test results of ICR mice and their reference ranges

圖4 ICR 小鼠在曠場試驗中各項指標的性別差異Fig.4 Gender differences of ICR mice in open field test

2.2 ICR 小鼠高架十字迷宮測試結果

ICR 小鼠在高架十字迷宮中的運動軌跡圖見圖5。

ICR 小鼠在高架十字迷宮中各項指標的測試結果及相應的95%置信區(qū)間如表2 所示。

圖5 高架十字迷宮小鼠活動軌跡圖（部分展示）Fig.5 Mouse activity trajectory map in plus maze test（partial display）

表2 ICR 小鼠高架十字迷宮測定結果及95%置信區(qū)間Table 2 Plus maze test results of ICR mice and their reference ranges

ICR 小鼠在高架十字迷宮中的性別差異如圖6所示，雄、雌ICR 小鼠在各區(qū)域滯留時間、運動距離和進入次數(shù)等各項指標中均無明顯差異。

圖6 ICR 小鼠在高架十字迷宮試驗中各項指標的性別差異Fig.6 Gender differences of ICR mice in plus maze test

3 討論

曠場試驗是評價嚙齒類動物運動功能和焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學方法之一，其原理是基于嚙齒類動物的趨觸性，即嚙齒類動物同時有畏懼空曠場地和探索行為新事物、新環(huán)境的天性，而在開闊的場地中其活動呈現(xiàn)趨避性。曠場試驗中常用小鼠的水平活動反映其運動活性，即自主活動能力；垂直運動反映小鼠對新異環(huán)境的探索程度，即探索行為行為[3]。研究的曠場試驗中靜止時間、運動時間和運動距離定是小鼠自主活動能力的主要評定指標；站立次數(shù)是小鼠探索行為行為的主要評定指標，雖然中央?yún)^(qū)域活動頻率也可以評價小鼠的探索行為，但我們考慮到小鼠的活動特性后并未使用。這些指標的測定結果和參考范圍并未與前人部分研究的結果完全一致[4-6]，這可能是因受試小鼠的品種[6-8]、周齡和體重等關鍵因素不同而產(chǎn)生了一定的影響。除此之外，我們認為更主要的原因是這些研究各自側重點有所不同，其研究人員針對曠場試驗進行了一定的修整。例如，在林曉春[4]的研究中，其測定時長僅設置為3 min，即使受試動物為大鼠，也導致其測定結果低于試驗；而在李騰飛[5]的試驗中，結合其測定時長和小鼠活動先強后弱的時相特點[9]考慮后，可以認為其結果與試驗高度符合。另外，各個研究中使用的數(shù)據(jù)采集軟件與試驗中采用的也有所不同，這也是一個不可忽視的因素。曠場試驗的中央、角落和周邊滯留時間及其與總時間百分比也可以作為小鼠的焦慮情緒評定指標[5，10]，但為避免受到小鼠的趨避性和活動時相特點的影響，焦慮樣情緒由高架十字迷宮和高架零迷宮搭配進行測定并討論，這樣一來更為合理。因為兩者的結果具有一致性，可以相互印證，能夠更好地反應動物焦慮的程度。因此，在這里對曠場試驗的相關結果只做了展示而未進行深入討論。

高架十字迷宮試驗是國際公認的動物焦慮行為測評的裝置[11]，自發(fā)明以來就被廣泛應用于大、小鼠的焦慮行為學研究，其原理是基于動物對新環(huán)境的探索行為和對高懸開放臂的恐懼而形成的矛盾沖突狀態(tài)，進而反映出動物的焦慮情緒[12]。試驗的高架十字迷宮試驗中選擇了小鼠進入開臂和閉臂的次數(shù)、滯留時間和滯留時間與總時間百分比作為動物焦慮表現(xiàn)的主要評定指標。這些指標的測定結果和參考范圍與前人部分研究的結果雖然仍一定的出入[13]，但考慮到如前所述的原因后，能夠認為結果較為一致。同時，我們認為在他們的研究中某些需要注意但極易忽略的操作可能并未得到較好的控制。例如，試驗開始時，是按人員需要手持小鼠使其背對實驗者放置在開臂與閉臂的接合處，且讓小鼠面對開臂。倘若面對閉臂，因小鼠嗜暗的天性（閉臂）[12]，結果將受很大影響；同時，同一試驗中所有小鼠均需面對同一開臂且裝置放置位置相對固定，否則可能會導致數(shù)據(jù)產(chǎn)生偏差，這也可能是某些數(shù)據(jù)離散程度較大的原因之一。

值得注意的是，雖然雄、雌小鼠本身存在一定的生理差別，但研究通過曠場試驗和高架十字迷宮試驗并未得出雄、雌鼠ICR 在焦慮樣情緒、探索行為行為和自主活動能力上存在性別差異。神經(jīng)行為學中關于小鼠兩性差異的報道不少，但多集中在認知功能[14]這一方面，受試動物也多是藥物成癮[15]、不良刺激和應激狀態(tài)[16-17]的雄、雌小鼠，正常狀態(tài)下小鼠神經(jīng)行為學的兩性差異并未得到足夠的關注。在劉友平[3]的研究中，雖然與我們所用小鼠品系不同，但也未發(fā)現(xiàn)性別對其試驗結果有所影響，這與研究結果基本一致。同時，這也可能與試驗前期對于小鼠嚴格管理有一定的關系，比如，篩選并剔除了異常和發(fā)情小鼠，避免了動情周期[18]的影響，也一定程度上降低了如雌二醇等雌激素水平波動的影響，而這正是造成大多數(shù)研究中兩性差異的重要因素之一。

神經(jīng)行為學試驗受到諸多因素的影響，除了動物遺傳變異[19]、晝夜節(jié)律和動情周期[20]等生物因素外，試驗環(huán)境、測試條件、操作和人員序等因素也會對其造成不可估量的影響。因此，我們在今后的神經(jīng)行為學試驗過程中應對小鼠的品系，周齡、營養(yǎng)及健康狀態(tài)、試驗環(huán)境適應程度等嚴格把控，確保如試驗時間段、試驗人員、燈光和光照強度[20]、氣味[21]、甚至墊料[22]等試驗條件一致。只有這樣才能科學的獲得有效數(shù)據(jù)；同時，在對試驗結果進行比較、參考時，我們也應留意這些因素的差異及其導致的改變，并作出適當?shù)恼{整。

4 結論

綜上所述，研究采用TM-Vision 系列行為學試驗系統(tǒng)進行視頻采集、參數(shù)記錄和統(tǒng)計，其靈敏度較高，能夠提取客觀定量數(shù)據(jù)；同時，研究的樣本量豐富，試驗相關因素控制精確，測定結果穩(wěn)定，數(shù)據(jù)具有較好的重復性和可信度，可以為今后的情緒障礙和感覺運動這兩大類神經(jīng)行為學研究提供有價值的參考。另外，基于試驗的結果，我們也認為雄、雌ICR小鼠在本試驗條件下其焦慮樣情緒、探索行為和自主活動能力不存在兩性差異。