李雁冰，王碩，李井春，孫天宇，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

家畜的人工授精技術(shù)起源于20 世紀初期，并于20 世紀30 年代掀起了研究熱潮，時至今日人工授精技術(shù)已成為養(yǎng)殖業(yè)的重要技術(shù)支撐之一。在2011 年1 月1 日頒布的文件《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》國標中指出豬常溫精液為“經(jīng)稀釋后在16～18 ℃下短期保存，仍具有受精能率的精液”[1]。人工授精技術(shù)作為重要的繁育方法，其中精液保存是人工授精技術(shù)重要的環(huán)節(jié)至關(guān)重要，與其他牲畜相比豬精子對溫度變化比較敏感，且常溫保存（17～25 ℃）不需要特殊設(shè)備，操作簡單方便，便于短期保存等優(yōu)點，因此是生產(chǎn)中豬精液保存的常用方法。在精子常溫保存過程中，豬精液稀釋液主要是為精子活動提供所需的能量，抑制微生物生長繁殖，創(chuàng)造相對穩(wěn)定的生存環(huán)境，從而達到保證豬精液品質(zhì)的目的。目前，豬稀釋液的pH 值、滲透壓、抗氧化能力等是豬精液保存過程中重要的影響因素，這些影響因數(shù)直接或間接的影響母豬的受胎率，研究表明人工授精中一次輸入損失的精子數(shù)量達到45%左右，那么通過提高精液質(zhì)量可提高受胎率[2-3]。

在常溫保存過程中，由于精子自身代謝等原因產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）致使細胞膜損傷，而在豬稀釋液中添加一定量的外源性抗氧化劑是目前最直接的方法，同時降低精子代謝速度也是有效措施。橙皮素（Hesperetin：Vitamin P）屬于生物類黃酮，植物提取物，具有消除氧自由基、抗氧化、抗癌等功能。在近些年相關(guān)研究中，劉亞偉[4]發(fā)現(xiàn)低溫保存中向豬精液稀釋液中添加橙皮素顯著地提高了精液的品質(zhì)，除此之外，橙皮素在豬精液常溫保存相關(guān)領(lǐng)域鮮有報道。在精液常溫保存時，在豬精液中加入稀釋液可以為精子提供一定能量，同時減少豬精子能量消耗，使精子存活的時間更長，提高精子的受精能力[5]。目前商品豬精液常溫保存多為3～5 d，為了更好地延長精子存活時間，提高精子的受精能力，試驗通過在Modena稀釋液中添加不同劑量的橙皮素，同時采用17 ℃和負壓環(huán)境條件，從溫度與低氧兩個方面降低精子代謝速度。試驗利用邁朗全自動精子質(zhì)量檢測儀檢測精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，探究橙皮素在17 ℃負壓環(huán)境下對豬精液保存效果，為稀釋液配方的完善提供一定的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

橙皮素購于上海源液生物技術(shù)有限公司；Modena 稀釋液組成為每1 L 溶液中含：青霉素0.074 g；鏈霉素0.05 g；葡萄糖27.50 g；NaHCO31 g；檸檬酸2.9 g；檸檬酸鈉6.9 g；TRIS 5.65 g；EDTA-2Na 2.6 g；BSA 4 g。Modena 稀釋液藥品成分均購自西格瑪公司。

1.1 精液來源

精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬場，采集3 頭健康長白種公豬混合精液，年齡為2～3 歲。無異味、色澤為乳白色、精子活力在0.7 以上的精液。

1.3 實驗方法

1.3.1 豬精液的稀釋

精液運送到實驗室后，將精液從保溫箱中取出放入無菌操作臺，用3 層紗布包裹后在室溫下平衡降溫30 min。平衡降溫后取10 μL 原精液滴入載玻片上，并放于37 ℃加熱板上孵育2～3 min，通過邁朗全自動精子分析儀檢測12 個視野區(qū)的豬精子質(zhì)量參數(shù)，精子活力不低于0.7[6]，精子質(zhì)量符合實驗標準后進行對原精液的稀釋處理。豬精液稀釋處理方法為將原精液分裝入15 mL 離心管中進行離心，離心轉(zhuǎn)數(shù)為1 800 r·min-1，離心時間為5 min。離心后去除上清液，采用精板計數(shù)法檢測離心后的濃縮精液的精子密度，用各組試劑稀釋液將濃縮精液稀釋計算調(diào)整密度為1×108個·mL-1，精液離心后對精液稀釋過程要在15 min 內(nèi)完成，避免由于精子沉積而造成機械損傷，稀釋后各稀釋組在室溫下保存待用。

1.3.2 精液保存處理

將稀釋后的各組試管口用鋁紙包裹封口，將各組試管緩慢置于負壓保存瓶中，用帶有空氣流通開關(guān)的活塞密封負壓保存瓶，將負壓保存瓶連接真空泵機，通過真空泵機將負壓保存瓶調(diào)整負壓為0.4 倍大氣壓強。負壓處理后將負壓保存瓶置于17 ℃恒溫箱中保存。每隔12 h 對各組試管中的精液進行緩慢混勻，避免精子沉聚而損傷。

1.3.3 精子質(zhì)量參數(shù)的檢測

根據(jù)試驗設(shè)計，在保存的各時間段（0 h，1，2，3，4，5 d）定時取樣，樣品需在37 ℃加熱板上復(fù)蘇2～3 min，通過邁朗全自動精子分析儀檢測精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)，并記錄實驗數(shù)據(jù)。

1.4 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)計5 組，在Modena 基礎(chǔ)稀釋液中添加橙皮素，調(diào)節(jié)濃度分別為0 L、40、80、120、160 μg·mL-1的橙皮素，試驗設(shè)3 次重復(fù)試驗。通過邁朗全自動精子分析儀檢查不同的保存時間下精子活率、活力、直線速度、側(cè)擺幅度、鞭打頻率、畸形率等質(zhì)量參數(shù)。1

.5 統(tǒng)計分析

將各時間段的各試驗組質(zhì)量參數(shù)數(shù)據(jù)利用Excel 進行匯總，再利用StatView 5.0 軟件對實驗測定的各項參數(shù)進行方差分析和多重比較，實驗結(jié)果用平均數(shù)±標準差來表示。同行數(shù)據(jù)肩標字母不同，表示差異顯著P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮素對精子活率的影響

由表1 可知，添加橙皮素后0 μg·mL-1L 組在17 ℃負壓環(huán)境下保存1～2 d 時的精子活率顯著高于160 μg·mL-1組（P＜0.05），而40、80、120 μg·mL-1組之間差異不明顯；在保存3 d 時，0、40 μg·mL-1組精子活率顯著高于80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；在4～5 d內(nèi)40 μg·mL-1組的精子活率顯著高于其組，且80、120 μg·mL-1組精子活率顯著高于0、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表1 橙皮素對精子活率的影響（單位：%）Table 1 The effect of hesperetin on sperm motility rate（unit:%）

2.2 橙皮素對精子活力的影響

由表2 可知，添加橙皮素后0、40 μg·mL-1組在17 ℃環(huán)境下保存1～2 d 時的精子活力顯著高于80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；在17 ℃環(huán)境下保存3 d 時，40、80 μg·mL-1組精子活力顯著高于0、120、160 μg·mL-1組且120、160 μg·mL-1組精子活力顯著高于0 μg·mL-1組（P＜0.05）；在17 ℃環(huán)境下保存4～5 d的時間內(nèi)40、80 μg·mL-1組的精子活力顯著高于0、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表2 橙皮素對精子活力的影響（單位：%）Table 2 The effect of hesperetin on sperm motility（unit:%）

2.3 橙皮素對精子直線速度的影響

由表3 可知，添加橙皮素后在17 ℃負壓環(huán)境下保存2 d 時，40 μg·mL-1組精子的直線速度顯著高于其他組（P＜0.05）；在保存3～4 d 內(nèi)40、80 μg·mL-1組的直線速度顯著高于其他組（P＜0.05）；在保存5 d時、40、80 μg·mL-1組的精子直線速度顯著高于120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表3 橙皮素對精子直線速度的影響（單位：μm·s-1）Table 3 The effect of hesperetin on sperm linear velocity（unit:%）

2.4 橙皮素對精子側(cè)擺幅度的影響

由表4 可知，添加橙皮素后在17 ℃負壓環(huán)境下保存1～2 d 內(nèi)的精子側(cè)擺幅度各組間無顯著差異（P＜0.05）；在保存3 d 時，各試驗組精子側(cè)擺幅度顯著高于0 μg·mL-1組（P＜0.05）；在保存4～5 d 內(nèi)40、80 μg·mL-1組 的 直 線 速 度 顯 著 高 于0、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）。

表4 橙皮素對精子側(cè)擺幅度的影響（單位：μm）Table 4 The effect of hesperetin on sperm Side swing amplitude（unit: μm）

2.5 橙皮素對精子鞭打頻率的影響

由表5 可知，添加橙皮素后、160 μg·mL-1組（P＜0.05）在17 ℃環(huán)境下保存1 d 時的精子鞭打頻率顯著高于120 μg·mL-1組（P＜0.05），其中0、80、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間的精子鞭打頻率無顯著差異，40、80、120 μg·mL-1組（P＜0.05）之間的精子鞭打頻率無顯著差異；在17 ℃環(huán)境下保存2 d 時5 個試驗組別的精子鞭打頻率無顯著差異；在17 ℃環(huán)境下保存3 d 時0 μg·mL-1組的精子鞭打頻率顯著高于40、80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）；其中80 μg·mL-1組的精子鞭打頻率顯著高于40 μg·mL-1組（P＜0.05），且80、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間無顯著差異，40、120、160 μg·mL-1組（P＜0.05）之間無顯著差異；在17℃環(huán)境下保存4～5 d 時5 個試驗組別的精子鞭打頻率無顯著差異。

表5 橙皮素對精子鞭打頻率的影響（單位：Hz）Table 5 The effect of hesperetin on sperm beat cross frequency（unit: Hz）

2.6 橙皮素對精子畸形率的影響

由表6 可知，添加橙皮素后40 μg·mL-1組在17 ℃負壓環(huán)境下保存1 d 時的精子畸形率顯著低于其他組（P＜0.05），在保存2～4 d 時0、120、160 μg·mL-1的精子畸形率顯著高于40、80 μg·mL-1組（P＜0.05）；在保存5 d 時0、160 μg·mL-1組（P＜0.05）的精子畸形率顯著高于80、120、40 μg·mL-1組（P＜0.05），且120、80 μg·mL-1組之間無顯著差異（P＜0.05）。

表6 橙皮素對精子畸形率的影響（單位：%）Table 6 The effect of hesperetin on abnormal sperm rate（unit:%）

3 討論

試驗中，選用的Modena 稀釋液對精子保存效果良好[7-8]。在豬精液中添加稀釋液能夠為豬精子提供類似于睪丸內(nèi)的理想存活環(huán)境，提高豬精子細胞膜的完整性，去除不利于豬精子長期保存的影響因素，為豬精子提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時在提高豬精液質(zhì)量和豬精子受精力的前提下降低豬精子代謝強度，使豬精子達到可逆轉(zhuǎn)的休眠狀態(tài)。在豬的稀釋粉中所含的多種成分對精液長期保存影響較大[9]，試驗在Modena 稀釋液中的葡萄糖等可以為豬精子代謝提供能量，緩沖物質(zhì)可維持豬精液pH 的穩(wěn)定，碳酸氫鈉、檸檬酸鈉可以中和細菌的代謝產(chǎn)物，從而維持相對穩(wěn)定的pH 環(huán)境[6]。而試驗中在稀釋液中添加橙皮素，目的在于提高精液的抗氧化能力，減弱由于豬精子和細菌代謝所產(chǎn)生的ROS 對豬精子的損傷，完善稀釋液的功能，為豬精子提供更易存活的理想環(huán)境。

在精子質(zhì)量檢測中精子活率是反映精液質(zhì)量的常規(guī)指標[10]。精子的活率指標和精子的運動性能參數(shù)與精子細胞結(jié)構(gòu)和精子功能存在高度的相關(guān)性，通過檢測這些質(zhì)量參數(shù)可以預(yù)測精子的潛在授精能力[11]。精子的運動性與授精能力存在相關(guān)性，是最重要的檢測手段之一，精子的運動性包括精子活率和運動速度[12-13]。所以試驗通過邁朗全自動精子分析儀檢測精子活率和運動速度，從試驗結(jié)果可知，隨著保存時間的增加，在4～5 d 期間40 μg·mL-1組的精子活率顯著高于其他組。這與劉亞偉[4]的研究結(jié)果趨于一致，橙皮素具有清除自由基和抗氧化的能力，其作用機理主要是阻止自由基在細胞內(nèi)形成的3 個階段，即與O2-反應(yīng)阻止自由基引發(fā)；與金屬離子螯合阻止OH-生成；與脂質(zhì)過氧基ROO-反應(yīng)阻止脂質(zhì)過氧化過程，橙皮素對常溫保存的豬精液品質(zhì)有一定程度的提高。在試驗中，在2 d 時各組都發(fā)現(xiàn)一定量的細菌滋生，這也可能是0 μg·mL-1組在3～4 d 時精子活率相較其他4 個試驗組下降趨勢明顯的主要原因。茆達干等[14]研究表明，精液中滋生一定量細菌后對精液保存效果影響較大，造成精子活力、頂體完整率、精液pH 值等質(zhì)量參數(shù)大幅度下降。試驗說明一定濃度的橙皮素能提高精子活率，并有一定的抑菌作用，橙皮素濃度為40 μg·mL-1為最佳。

實踐證明，所輸精液量和精子活力對配種效率、產(chǎn)仔數(shù)、仔豬斷奶成活率、斷奶體重和生產(chǎn)性能都有很大影響，活力對于精子受精能力是很重要的，是保證精子在受精過程中與卵子相遇的重要條件[15-16]。從試驗結(jié)果可以看出隨著保存時間的增加，稀釋液中的精子活力呈明顯下降趨勢。在17 ℃環(huán)境下保存的2 d 內(nèi)，0 μg·mL-1組、40 μg·mL-1組的精子活力已顯著高于其他試驗組，但在第3 d 起40 μg·mL-1組的精子活力顯著優(yōu)于其他4 個試驗組，且對照組保存效果最不理想，究其原因可能是4 個試驗組在試驗2 d開始有存在不同程度的細菌滋生。精子直線速度參數(shù)是反映精子活力的重要指標之一，無論是直線運動的精子，還是環(huán)繞運動的豬精子或者是原地運動的豬精子，它們都有活動的能力，可以說都有活力[17]。而直線運動的精子才屬于有效精子，因而精子的直線速度相較于其他速度指標更具有代表性。試驗中從2 d 開始，40 μg·mL-1組精子的直線速度顯著高于其他組，而1 d 時各組差異不明顯，研究表明黃酮類化合物被吸收后往往通過血清白蛋白進行貯存和運送，進而發(fā)揮作用[18]。而橙皮素與血清蛋白形成絡(luò)合物的時間與Cu2+等金屬離子有關(guān)，而精液稀釋液配制采用的均為去離子水，可能因此影響了藥效發(fā)揮時間。從而說明一定濃度的橙皮素能提高精子直線速度和間接提高精子活力，對精子保存有促進作用，橙皮素濃度為40 μg·mL-1為最佳。

哺乳動物精子在進出雌性生殖道獲能前運動方式變化很大，在此期間精子經(jīng)歷了復(fù)雜的生理變化，運動方式發(fā)生了很大的改變，運動狀態(tài)更為強烈，表現(xiàn)出“鞭打”“小環(huán)形拋物”等運動形式，這樣的過程被稱為超激活[19]，超激活主要表現(xiàn)形式是鞭毛鞭打的程度不對稱性和相對較高的鞭打振幅[20]。超激活現(xiàn)象與精子的運動方式有關(guān)，有學(xué)者將側(cè)擺幅度（ALH）≥7 μm 作為其參數(shù)指標，用以鑒定超激活運動。精子的鞭打頻率即精子的頭部運動偏離精子運動平均路徑的頻率，由試驗結(jié)果可以看出，隨著時間的推移，所有試驗組別的精子鞭打頻率呈現(xiàn)遞減趨勢，但是并未篩選出最適宜濃度組，但試驗組與對照組的精子鞭打頻率并無顯著差異，說明添加適量濃度橙皮素試驗組對于精子鞭打頻率并無抑制作用，對此其相關(guān)作用機制有待進一步研究。同時畸形率對精子運動性也存在一定的影響，研究表明化學(xué)物質(zhì)，環(huán)境溫度，細菌病毒感染，遺傳因素等均可引起精子畸形。從試驗結(jié)果可知，添加橙皮素后在3～4 d 內(nèi)40 μg·mL-1組、80 μg·mL-1組的側(cè)擺幅度顯著高于其他組，且40 μg·mL-1組從1 d 開始畸形率要明顯低于其他組，說明橙皮素抗病毒抑菌作用在極低濃度就可抑制致病革蘭氏陰性菌，從而降低了畸形率和提高側(cè)擺幅度。同時試驗采用負壓處理，模擬公豬睪丸負壓低氧環(huán)境，可有效降低精液含氧量，減緩精子代謝過程，再結(jié)合橙皮素的抗氧化和抗病毒抑菌作用，從而提高精液配方的抗氧化性和抑菌作用，延長精液的保存時間。

4 結(jié)論

試驗得出在精液基礎(chǔ)液中添加一定量的橙皮素在17 ℃負壓環(huán)境下可顯著提高豬精子的活率、直線速度、側(cè)擺幅度，降低精子畸形率。其中40 μg·mL-1組各項參數(shù)顯著優(yōu)于其他組，添加40 μg·mL-1的橙皮素最有利于豬精子在17 ℃環(huán)境下的保存，研究結(jié)果為豬人工授精生產(chǎn)實踐中精液保存技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。