沈陽(yáng)，才曉溪，賈博為，孫明哲，周伍紅，楊珺凱，胡冰霜，孫曉麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319）

土地鹽堿化嚴(yán)重威脅我國(guó)乃至世界農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的正常發(fā)展，全世界約20%的可耕種地和50%的灌溉地受鹽堿化影響。中國(guó)東北松嫩平原是世界三大鹽堿地之一，鹽堿地面積高達(dá)370 多萬(wàn)hm2。因此，土地鹽堿化嚴(yán)重制約了我國(guó)東北地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，限制了糧食產(chǎn)量。隨著我國(guó)人口的持續(xù)增長(zhǎng)和可耕種土壤的退化，合理開(kāi)發(fā)利用鹽堿地是增加我國(guó)糧食產(chǎn)量的重要舉措，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

作為固著的、不可移動(dòng)的生命有機(jī)體，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了一系列的應(yīng)對(duì)外界脅迫的機(jī)制。如何維持胞內(nèi)外離子平衡是植物應(yīng)對(duì)外界逆境的關(guān)鍵。陽(yáng)離子質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CPA，cation proton antiporter）作為不同單價(jià)陽(yáng)離子外流耦合器[1]，通過(guò)減少Na+內(nèi)流，促進(jìn)其外流及區(qū)隔化，保證胞質(zhì)內(nèi)較低的Na+含量，參與植物對(duì)外界逆境脅迫的應(yīng)答[2]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，CPA 家族分為CPA1 和CPA2 兩個(gè)亞家族。其中CPA1 亞家族包括研究的較為透徹的NHX 家族，而CPA2 家族包括KEA（K+-efflux antiporter）和CHX（cation/H+exchanger）[3]，并且CPA2 主要存在于細(xì)菌、真菌和植物中[4]。關(guān)于植物CHX 基因家族的研究近年來(lái)才逐漸開(kāi)展。迄今發(fā)現(xiàn)的CHX 蛋白都有約800 個(gè)氨基酸，包括N 末端約400 個(gè)氨基酸的疏水性Na+/H+交換器以及C 末端約300～400 的親水性結(jié)構(gòu)域。

植物CHXs 家族成員數(shù)目眾多，擬南芥有28 個(gè)，水稻有17 個(gè)，而大豆中則有46 個(gè)[3]。目前對(duì)CHXs 的研究多集中在基因表達(dá)和功能鑒定方面。例如AtCHX13 基因與K+攝取密切相關(guān)，chx13 突變體植株對(duì)低K+敏感[5]。AtCHX14 參與調(diào)節(jié)K+平衡及K+循環(huán)再利用[6]。AtCHX17 基因表達(dá)受高鹽、低K+誘導(dǎo)，缺K+時(shí)chx17 突變體根部K+含量減少[7-9]。AtCHX20 參與氣孔保衛(wèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[10]。

雖然目前研究已證實(shí)CHXs 在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境應(yīng)答中的功能，但尚未明確其應(yīng)答機(jī)制，對(duì)CHXs 互作蛋白的研究也鮮有報(bào)道。課題組前期從野生大豆中鑒定出一個(gè)耐鹽堿基因CHX19.3，并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選CHX19.3 互作蛋白，發(fā)現(xiàn)其互作蛋白中有1 個(gè)14-3-3 蛋白。研究克隆了10 個(gè)野生大豆14-3-3 家族基因，并進(jìn)一步驗(yàn)證GsCHX19.3與14-3-3 家族蛋白的相互作用，為深入了解其蛋白互作機(jī)制，揭示CHXs 調(diào)控耐鹽堿性的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生大豆G07256 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因工程研究室提供。酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）NMY51 菌株、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 菌株、酵母雙雜交表達(dá)載體pBT3-STE、pPR3-N、pOst1-NubI、pTSU2-APP 和pNubG-Fe65 為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1 GsCHX19.3 蛋白序列及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從Phytozome（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載擬南芥同源基因的蛋白序列，利用ClustalX 程序進(jìn)行蛋白序列多重比對(duì)，利用SMART在線軟件（http://smart.embl -heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用SOSUI 在線軟件（http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.3 GsCHX19.3 基因酵母雙雜交載體構(gòu)建

以pEASY-T3-GsCHX19.3 質(zhì)粒為模板，采用含SfiI 酶切位點(diǎn)的基因特異引物（FP：ATTAACAAGGCCATTACGGCCATGATGGCGACGAGTAACAACGCG和RP：AACTGATTGGCCGAGGCGGCCCCACTCGTTGGTGTGTCT）擴(kuò)增GsCHX19.3 基因CDS 區(qū)，PCR 產(chǎn)物回收后用SfiI 酶切，與SfiI 線性化的pBT3-STE 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 鑒定，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆送交測(cè)序。

1.4 GsCHX19.3 誘餌蛋白毒性檢測(cè)

采用LiAc 法，將pBT3-STE-GsCHX19.3 和pBT3-STE 分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞NMY51，菌液涂布于SD/-Leu 篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d 獲得單克隆。采用pBT3-STE 載體通用引物（FP：5′- TGGCATGCATGTGCTCTG -3′ 和RP：5′ -GTAAGGTGGACTCCTTCT-3′）PCR 鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。分別挑取3 個(gè)陽(yáng)性克隆，用SD/-Leu 液體培養(yǎng)基活化，30 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將菌液濃度調(diào)整OD600=1.0，按1∶100 接種于SD/-Leu 液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)4、8、12、16、20、24、48 h 測(cè)量OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 GsCHX19.3 誘餌蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)驗(yàn)證

采用表1 中的組合進(jìn)行酵母共轉(zhuǎn)化，分別涂布于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d 后觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)反應(yīng)在不同培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計(jì)算SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 菌落生長(zhǎng)率即SD/-Trp-Leu-His 或SD/-Trp-Leu-His-Ade菌落數(shù)除以SD/-Trp-Leu 菌落數(shù)。其中反應(yīng)3 為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)4 為陰性對(duì)照。若反應(yīng)1 中酵母可以在SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而反應(yīng)2 不能生長(zhǎng)，則誘餌蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)符合該酵母雙雜交系統(tǒng)。

1.6 野生大豆14-3-3 基因克隆及酵母表達(dá)載體構(gòu)建

采用Trizol 法提取野生大豆幼苗總RNA，經(jīng)DNase 消化基因組DNA 后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA 為模板，采用含酶切位點(diǎn)的基因特異引物（表2），用高保真聚合酶PCR 擴(kuò)增野生大豆GsGF14s 基因CDS 區(qū)，PCR 產(chǎn)物采用試劑盒回收。將PCR 產(chǎn)物和pPR3-N 質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，并將陽(yáng)性克隆送交測(cè)序。

表1 GsCHX19.3 誘餌蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析Table 1 Analysis of GsCHX19.3 topological structure

表2 野生大豆14-3-3 蛋白GsGF14s 基因特異引物Table 2 Gene specific primers of wild soybean 14-3-3 genes GsGF14s

1.7 酵母雙雜交驗(yàn)證GsCHX19.3 與14-3-3 蛋白相互作用

將pBT3-STE-GsCHX19.3 分別與pPR3-N（陰性對(duì)照）、pOst1-NubI（陽(yáng)性對(duì)照）、pPR3N-GsGF14s 共轉(zhuǎn)化酵母NMY51，涂布于SD/-Trp-Leu 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d。分別采用pBT3-STE（FP：5′- TGGCATGCATGTGCTCTG-3′和RP：5′- GTAAGGTGGACTCCTTCT-3′）和pPR3-N（FP：5′- GTCGAAAATTCAAG ACAAGG-3′和RP：5′-AAGCGTGACATAACTAATTAC-3′）載體通用引物進(jìn)行PCR 鑒定，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。用SD/-Trp-Leu 液體培養(yǎng)基活化陽(yáng)性克隆，將菌液濃度調(diào)整OD600=0.6，按1∶10、1∶100、1∶1 000 進(jìn)行梯度稀釋，取1 μL 菌液分別點(diǎn)點(diǎn)至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d 后觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsCHX19.3 蛋白序列分析

前期研究克隆了野生大豆GsCHX19.3 基因全長(zhǎng)CDS 區(qū)（2 442 bp），編碼813 個(gè)氨基酸，屬于Na+、K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體CHX 家族。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GsCHX19.3 與擬南芥同源蛋白序列相似度較高（圖1A）。SMART 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示GsCHX19.3 蛋白N端含有一個(gè)典型的Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

2.2 GsCHX19.3 蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SOSUI 在線軟件預(yù)測(cè)GsCHX19.3 蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白N 端位于胞外，具有11 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，C 端則有1 個(gè)很長(zhǎng)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（圖2）。因此，研究選用針對(duì)膜蛋白的基于泛素分裂的酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行蛋白互作研究。

圖1 GsCHX19.3 蛋白序列及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of GsCHX19.3 protein sequences and conserved domains

圖2 GsCHX19.3 蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of GsCHX19.3 topological structure

2.3 GsCHX19.3 誘餌蛋白酵母雙雜交載體構(gòu)建

根據(jù)蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，研究選用pBT3-STE 誘餌載體，將GsCHX19.3 蛋白C 端與Cub-Lex－A-VP16 融合表達(dá)，使Cub-LexA-VP16 位于胞內(nèi)（圖3A）。采用含酶切位點(diǎn)的基因特異引物擴(kuò)增GsCHX19.3，與線性化的載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 鑒定（圖3B），并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到與GsCHX19.3 基因大小相符的條帶（圖3C），證明GsCHX19.3 誘餌蛋白酵母雙雜交表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 GsCHX19.3 誘餌蛋白酵母雙雜交載體構(gòu)建Fig.3 Construction of GsCHX19.3 expression vector for yeast two hybrid assays

2.4 GsCHX19.3 誘餌蛋白毒性檢測(cè)

將pBT3-STE-GsCHX19.3 和pBT3-STE 分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞NMY51，測(cè)定重組酵母菌的生長(zhǎng)曲線。如圖4 所示，兩種重組酵母菌在不同時(shí)間點(diǎn)的OD600值基本相同，生長(zhǎng)曲線走勢(shì)大致相同，說(shuō)明轉(zhuǎn)化pBT3-STE-GsCHX19.3 和pBT3-STE 的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度基本一致，即GsCHX19.3 蛋白的表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性，可進(jìn)行下一步酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

圖4 GsCHX19.3 誘餌蛋白細(xì)胞毒性檢測(cè)Fig.4 Cytotoxicity detection of GsCHX19.3 bait protein in yeast cells

2.5 GsCHX19.3 誘餌蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)驗(yàn)證

采用表1 中的組合進(jìn)行酵母共轉(zhuǎn)化，分析重組菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，鑒定GsCHX19.3 蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。如圖5 所示，pTSU2-APP/pNubGFe65（陽(yáng)性對(duì)照）重組酵母在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)（表3）；而pTSU2-APP/pPR3-N（陰性對(duì)照）重組酵母在SD/-Trp-Leu 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。

含有pBT3-STE-GsCHX19.3/pOst1-NubI 的酵母細(xì)胞在SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，且菌落生長(zhǎng)百分率均大于70%（表3）。這一結(jié)果表明，與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，GsCHX19.3 蛋白C 端位于胞內(nèi)，當(dāng)GsCHX19.3-Cub-LexA-VP16 重組蛋白的Cub 與Ost1-NubI（即未突變的Nub）結(jié)合形成完整的泛素后，可釋放Lex－A-VP16，使其進(jìn)入細(xì)胞核激活報(bào)告基因表達(dá)。這一結(jié)果表明GsCHX19.3-Cub-LexA-VP16 融合蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)符合該酵母雙雜交系統(tǒng)，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。含pBT3-STE-GsCHX19.3/pPR3-N 的酵母細(xì)胞在SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 上均不能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明GsCHX19.3-Cub-LexA-VP16 不能與突變的NubG 結(jié)合，報(bào)告基因不能表達(dá)（圖5），說(shuō)明SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 篩選培養(yǎng)基可作為下一步酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的篩選條件。

圖5 不同反應(yīng)的重組酵母在不同選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth performance of transformed yeasts on different SD medium

表3 GsCHX19.3 蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)驗(yàn)證Table 3 Identification of the topological structure of GsCHX19.3 protein

2.6 野生大豆14-3-3 基因克隆及酵母表達(dá)載體構(gòu)建

前期對(duì)大豆14-3-3 家族分析發(fā)現(xiàn)，該家族存在大量的基因復(fù)制現(xiàn)象，且同組內(nèi)14-3-3 蛋白的序列相似度非常高[11]。為了分析GsCHX19.3 與14-3-3 家族蛋白的相互作用，研究根據(jù)家族進(jìn)化關(guān)系選取了其中10 個(gè)GsGF14s 基因進(jìn)行研究。

前期研究表明大豆GsGF14s 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核[12]，且利用HMMTop 在線軟件預(yù)測(cè)未發(fā)現(xiàn)任何跨膜結(jié)構(gòu)域。因此研究選用pPR3-N 表達(dá)載體，使NubG-GsGF14s 進(jìn)行融合表達(dá)（圖6A）。以野生大豆cDNA 為模板，采用含酶切位點(diǎn)的基因特異引物擴(kuò)增GsGF14s 基因，與線性化的pPR3-N 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 鑒定（圖6B），并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切得到與目標(biāo)基因大小相符的條帶（圖6C），證明GsGF14s 基因酵母雙雜交表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.7 酵母雙雜交分析GsCHX19.3 與14-3-3 蛋白相互作用

為了研究GsCHX19.3 與14-3-3 家族蛋白的相互作用，將pBT3-STE-GsCHX19.3 分別與pPR3-N（陰性對(duì)照）、pOst1-NubI（陽(yáng)性對(duì)照）和pPR3N-Gs－GF14s 共轉(zhuǎn)化酵母。將重組菌活化后菌液濃度調(diào)平至OD600=0.6，按1∶10、1∶100、1∶1 000 梯度稀釋后，分別點(diǎn)點(diǎn)至SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基。如圖7 所示，pBT3-STEGsCHX19.3/pOst1-NubI 重組酵母在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His-Ade 培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，而pBT3-STE-GsCHX19.3/pPR3-N 重組酵母在SD/-Trp-Leu 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在SD/-Trp-Leu-His 和SD/-Trp-Leu-His-Ade 上不能生長(zhǎng)。

除GsGF14f 外，其余pBT3-STE-GsCHX19.3/pPR3N-GsGF14s 重組菌均和陰性對(duì)照一樣，在SD/-Trp-Leu 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，但在SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade 上不能生長(zhǎng)。而含pBT3-STE-GsCHX19.3/pPR3N-GsGF14f 的重組菌在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His、SD/-Trp-Leu-His -Ade培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，10 個(gè)野生大豆14-3-3 蛋白中，只有GsGF14f 和GsCHX19.3 蛋白具有相互作用，說(shuō)明GsCHX19.3 和14-3-3 蛋白的相互作用具有特異性。

圖6 GsGF14s 基因酵母雙雜交表達(dá)載體構(gòu)建Fig.6 Construction of GsGF14s expression vector for yeast two hybrid assays

圖7 酵母雙雜交分析GsCHX19.3 與14-3-3 蛋白相互作用Fig.7 Y2H identification of protein interaction between GsCHX19.3 and GsGF14s

3 討論

隨著生物信息學(xué)和功能基因組學(xué)的飛速發(fā)展，科研工作者已從多種植物中鑒定了CHXs 基因家族，并揭示了其在生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答中的重要角色[13]。如AtCHX16-19 參與植物生殖生長(zhǎng)和種子發(fā)育調(diào)控過(guò)程[13]。AtCHX20 在保衛(wèi)細(xì)胞中高表達(dá)，調(diào)控氣孔開(kāi)關(guān)[10]。AtCHX21 調(diào)控木質(zhì)部Na+平衡和葉片中Na+積累[14]。然而，CHXs 基因究竟如何發(fā)揮功能？目前研究?jī)H關(guān)注于其在離子轉(zhuǎn)運(yùn)和pH 平衡中的作用，尚未有研究報(bào)道CHXs 蛋白是如何被調(diào)控的。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選鑒定互作蛋白，是研究基因分子機(jī)制的一種有效途徑[15-18]。與免疫共沉淀、Pull down 等其他體外分析蛋白互作的技術(shù)相比，酵母雙雜交具有操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)。

在前期研究中，課題組利用野生大豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[19]，篩選獲得了鹽堿脅迫應(yīng)答的GsCHX19.3基因。該基因與擬南芥同源基因高度相似（圖1A），其蛋白N 端含有一個(gè)典型的Na+/H+exchanger 結(jié)構(gòu)域（圖1B）。我們前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選GsCHX19.3 互作蛋白，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)14-3-3 蛋白。研究進(jìn)一步鑒定了GsCHX19.3 和大豆14-3-3 家族蛋白的相互作用特異性。

由于CHXs 蛋白一般定位于膜系統(tǒng)，而膜蛋白的正確折疊往往需要特定的疏水性環(huán)境，否則其結(jié)構(gòu)和功能將會(huì)改變，蛋白相互作用也將會(huì)受到抑制。分離泛素酵母雙雜交系統(tǒng)通過(guò)待檢測(cè)蛋白質(zhì)間的互作，將突變的泛素N 端NubG 和C 端Cub 融合，使報(bào)告蛋白LexA-VP16 解離入核，從而激活報(bào)告基因表達(dá)[20-23]。與傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)相比，分離泛素系統(tǒng)的蛋白互作不再局限于核內(nèi)，更適合于膜蛋白相互作用研究。GsCHX19.3 蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其具有11 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，N 端位于胞外，C 端位于胞內(nèi)（圖2）。因此，研究采用針對(duì)膜蛋白的基于泛素分裂的酵母雙雜交系統(tǒng)[16，24]，選用pBT3-STE 作為誘餌載體，使GsCHX19.3 蛋白C 端與Cub-LexA-VP16 融合表達(dá)（圖3）。酵母生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)表明GsCHX19.3 蛋白對(duì)于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒性作用（圖4），GsCHX19.3 蛋白C 端位于胞內(nèi)。當(dāng)GsCHX19.3-Cub-LexA-VP16 重組蛋白的Cub 與Ost1-NubI 中未突變的NubI 結(jié)合形成完整的泛素后，釋放LexA-VP16，使其入核激活報(bào)告基因表達(dá)（圖5）。

14-3-3 蛋白是一類(lèi)廣泛存在的、高度保守的蛋白家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[25-27]。大豆中共發(fā)現(xiàn)18 個(gè)14-3-3 蛋白，分別命名為GsGF14a-p[9]。其中，GsGF14c 和GsGF14l 在大豆根瘤形成的早期階段和異黃酮合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[28-29]。我們前期也發(fā)現(xiàn)GsGF14o 參與調(diào)控根毛和氣孔發(fā)育，以及對(duì)ABA 和干旱脅迫的應(yīng)答過(guò)程[30]。研究表明14-3-3 蛋白往往通過(guò)與其他蛋白相互作用，增強(qiáng)或抑制靶蛋白的催化活性，或調(diào)節(jié)靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，或影響靶蛋白與其他蛋白的相互作用，或保護(hù)靶蛋白被降解[31]。例如大豆中，GmMYB176、GmMYB62 和GmMYB173 能夠與所有14-3-3 蛋白互作，且SGF14l 能通過(guò)蛋白互作，調(diào)控MYBs 在細(xì)胞內(nèi)的定位[29，32]。擬南芥14-3-3λ 能夠與SOS2 互作抑制SOS2 活性，使其無(wú)法激活Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體SOS1[33]。此外，14-3-3 蛋白也能夠與H+-ATPase 相互作用調(diào)控植物對(duì)堿脅迫的應(yīng)答過(guò)程[34-35]。

研究中我們鑒定了10 個(gè)野生大豆14-3-3 家族蛋白與GsCHX19.3 的相互作用，發(fā)現(xiàn)只有GsGF14f能夠與GsCHX19.3 互作（圖7）。這一結(jié)果說(shuō)明與MYB 轉(zhuǎn)錄因子不同，GsCHX19.3 與14-3-3 蛋白的相互作用具有特異性。但我們未能在GsCHX19.3 氨基酸序列中找到14-3-3 蛋白結(jié)合的典型模序RSXpSXP 和RXY/FXpSXP[36]。因此推測(cè)GsGF14f 可能是通過(guò)識(shí)別非磷酸化的序列與GsCHX19.3 互作。

在今后的研究中，將進(jìn)一步利用BiFc 或CoIP 技術(shù)驗(yàn)證GsGF14f 與GsCHX19.3 蛋白相互作用，并著重關(guān)注以下3 個(gè)問(wèn)題：GsGF14f 與GsCHX19.3 互作的識(shí)別序列是什么？GsGF14f 對(duì)GsCHX19.3 蛋白的調(diào)控作用又是什么？GsGF14f 基因是否和GsCHX19.3一樣，調(diào)控植物對(duì)鹽堿脅迫的應(yīng)答過(guò)程？

4 結(jié)論

構(gòu)建了pBT3-STE-GsCHX19.3 誘餌載體，其在酵母體內(nèi)表達(dá)的GsCHX19.3-Cub-LexA-VP16 融合蛋白對(duì)酵母菌沒(méi)有毒性，且拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)符合該酵母雙雜交系統(tǒng)。酵母雙雜交結(jié)果顯示，只有GsGF14f 能夠與GsCHX19.3 蛋白互作，其余14-3-3 蛋白與GsCHX19.3 均不存在相互作用，即GsCHX19.3 與野生大豆14-3-3 蛋白互作具有特異性。