谷曉杰，安麗，何曉婷，馮雪，楊春，武文卿，李少華，曹揮

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801)

由貝氏葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的蘋果輪紋病是目前制約蘋果品質(zhì)提升、產(chǎn)量提高的“頭號禍根”,其在被害枝干上以菌絲體、分生孢子器及子囊殼進(jìn)行越冬,條件適宜時(shí)產(chǎn)生的分生孢子成為該病的侵染源[1,2]。蘋果輪紋病主要危害蘋果樹的枝干及果實(shí)。病菌侵染枝干后發(fā)病部位凸起,周圍樹皮裂開并翹起。次年以此發(fā)病部位為中心向四周不斷擴(kuò)展,形成同心輪紋狀病斑。該病害具有潛伏期,田間青果被侵染后有近50%不表現(xiàn)癥狀,在果實(shí)成熟或儲(chǔ)藏過程中才開始發(fā)病,侵染后期出現(xiàn)黑色僵果,并在表面產(chǎn)生子實(shí)體[3～7]。

利用植物自身防御功能及植物與有害生物協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)物—次生代謝物質(zhì)進(jìn)行植物源農(nóng)藥研發(fā)是當(dāng)前農(nóng)藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)[8～10]。八角茴香(Illiciumverum)屬于木蘭科八角屬,主要分布在我國云南、貴州、四川等省,是我國重要的“藥食同源”樹種之一[11]。八角茴香作為調(diào)料與香辛料在食品加工及香料工業(yè)中被廣泛應(yīng)用；同時(shí)八角茴香作為一種藥材,可用于治療消化不良,神經(jīng)衰弱等病癥[12,13]。有研究發(fā)現(xiàn)八角茴香精油對醫(yī)學(xué)和食品中的致病細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14]；八角茴香精油對于一些貯糧害蟲也具有良好的滅殺和趨避作用[15,16]。同時(shí),八角茴香油精對棉花枯萎病菌也表現(xiàn)出較明顯的抑制作用[17],但有關(guān)八角茴香精油抑菌機(jī)理的報(bào)道相對較少。

本研究以蘋果輪紋病為研究對象,篩選了17種植物試驗(yàn)其抑菌活性,并對效果最好的八角茴香中的主要活性成分反式茴香腦展開進(jìn)一步研究,為新型植物源殺菌劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物:分別為13個(gè)科17個(gè)種(表1)；

反式茴香腦:購自上海麥克林生化科技有限公司；

供試菌種:蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria),由山西農(nóng)大植物病理系提供。

表1 供試植物樣品Table 1 Test plant samples

1.2 方法

1.2.1 17種植物提取物對蘋果輪紋病的抑制作用

采用菌絲生長速率法[18]進(jìn)行抑菌活性測定。

1.2.2 八角茴香與博落回2種植物提取物對蘋果輪紋病菌的抑制中濃度

針對蘋果輪紋病菌,選取抑制效果最好的植物提取物,利用二倍稀釋法[19]將八角茴香與博落回2種植物提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125 g·L-1共5個(gè)濃度并制作加藥培養(yǎng)基,測定各濃度對應(yīng)的抑菌率,統(tǒng)計(jì)分析得到不同植物提取物對病原菌的抑制中濃度。

1.2.3 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的抑制中濃度

反式茴香腦為八角茴香提取物中的主要有效成分,利用二倍稀釋法將反式茴香腦配制成成1、0.5、0.25、0.125、0.063 g·L-1共5個(gè)濃度并制作加藥培養(yǎng)基,測定各濃度對應(yīng)的抑菌率,統(tǒng)計(jì)分析得到反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的抑制中濃度。

1.2.4 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

采用考馬斯亮藍(lán)法測定[20]菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量。

1.2.5 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)丙酮酸含量的影響

采用紫外分光光度法測定[21]菌絲體內(nèi)丙酮酸含量。

1.2.6 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)還原糖含量的影響

采用DNS法測定[22]菌絲體內(nèi)還原糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 17種植物提取物對蘋果輪紋病菌的抑制作用

通過對比分析,濃度為2 g·L-1時(shí),八角茴香、博落回2種植物提取物對蘋果輪紋病菌菌絲抑制率最好,96 h均無菌絲生長,達(dá)到了100%(圖1)。17種植物提取物對蘋果輪紋病菌菌絲生長的抑制作用見表2。

A：空白對照；B：八角茴香提取物；C:博落回提取物A:CK; B:Illicium verum extract; C：Macleaya cordata extrat圖1 八角茴香與博落回提取物對蘋果輪紋病菌菌絲生長抑制圖Fig.1 Inhibition of the growth of apple ringworm mycelium by Illicium verum and Macleaya cordata

2.2 八角茴香與博落回2種植物提取物對蘋果輪紋病原菌的抑制中濃度

運(yùn)用DPS軟件對96 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分別求出八角茴香、博落回2種植物提取物在處理蘋果輪紋病菌后的毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50)(表3)。

由表3可知,在96 h下八角茴香與博落回提取物對蘋果輪紋病病原菌的EC50分別為0.297 6、0.265 0 g·L-1,兩者相比,八角茴香提取物的抑菌效果更好。

表2 17種植物提取物對蘋果輪紋病菌菌絲的抑制作用Table 2 Inhibition of 17 plant extracts on the hyphae of Botryosphaeria

表3 八角茴香和博落回提取物在96 h對蘋果輪紋病菌的毒力作用Table 3 The toxicity of extract from I.verum and M.cordata against Botryosphaeria at 96 h

2.3 反式茴香腦對蘋果輪紋病原菌的抑制中濃度

運(yùn)用DPS軟件對48 h、72 h、96 h后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分別求出反式茴香腦作用蘋果輪紋病菌后的毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50)(表4)。由表可知,反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的抑菌作用與時(shí)間呈反比,時(shí)間越長抑菌作用逐漸減弱。

表4 反式茴香腦在不同時(shí)間對蘋果輪紋病菌的毒力作用Table 4 The toxicity of extract from trans-Anethole against Botryosphaeria at different times

2.4 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后蘋果輪紋病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量見表5。從表中可知,經(jīng)反式茴香腦處理后菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量隨著濃度的升高而降低。當(dāng)反式茴香腦濃度為1 g·L-1時(shí)菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量最低,與CK相比在5%水平下存在顯著性差異。當(dāng)反式茴香腦濃度為0.063 g·L-1時(shí)菌絲體內(nèi)的可溶性蛋白含量與CK相比幾乎沒有變化,在5%水平下無顯著性差異。

表5 不同濃度處理下菌絲體內(nèi)可溶性蛋白的含量

2.5 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)丙酮酸含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后蘋果輪紋病菌絲體內(nèi)丙酮酸含量見表6。從表中可知,蘋果輪紋病菌絲體經(jīng)反式茴香腦處理后菌絲體內(nèi)的丙酮酸含量隨著其濃度的增大呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)反式茴香腦濃度為1 g·L-1與CK之間菌絲體內(nèi)丙酮酸含量在5%水平下存在顯著性差異。

2.6 反式茴香腦對蘋果輪紋病菌菌絲體內(nèi)還原糖含量的影響

經(jīng)反式茴香腦處理3 d后供試菌菌絲體內(nèi)還原糖含量見表7。從表中可知,經(jīng)反式茴香腦處理的菌絲體內(nèi)的還原糖都有減少,且反式茴香腦的濃度與還原糖的含量成反比。當(dāng)濃度為0.5 g·L-1、1.0 g·L-1與CK之間菌絲體還原糖含量在5%水平下存在顯著性差異,反式茴香腦濃度為0.063 g·L-1與CK之間菌體內(nèi)還原糖含量上無顯著性差異。

表7 不同濃度處理下菌絲體內(nèi)還原糖的含量

3 討論與結(jié)論

目前,已有學(xué)者研究了植物源殺菌劑對蘋果輪紋病菌的抑制作用。如程永芳[23]、趙剛[24]、劉保友[25]等研究了對蘋果輪紋病菌抑制效果明顯的植物提取物,分別為5 g·L-1的黎蘆乙醇提取物、50 g·L-1韭菜提取液和0.002 g·L-1丁子香酚,其抑制率為74.3%、100%、90%。本研究測定了17種植物提取物對蘋果輪紋病菌的抑菌活性,結(jié)果表明處理濃度2 g·L-1,處理時(shí)間96 h時(shí),八角茴香與博落回提取物對蘋果輪紋病菌的抑制率均達(dá)到100%。分別對其進(jìn)行毒力測定,八角茴香提取物對蘋果輪紋病菌的抑菌作用更強(qiáng),其EC50為0.265 0 g·L-1。

八角茴香揮發(fā)精油是從八角枝、葉、果實(shí)通過蒸餾法或萃取法進(jìn)行提取的一種芳香精油,其常溫呈無色至淡黃色液體,而低溫時(shí)凝結(jié)為白色的晶體,氣芳香,味辛甜[26]。郭勇[27]、李祖光[28]、陽小勇[29]等采用不同的提取方法均得到八角茴香揮發(fā)精油中的主要成分為反式茴香腦。本研究進(jìn)一步對反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的抑菌作用進(jìn)行了研究,結(jié)果表明該物質(zhì)對病原菌的EC50為0.160 0 g·L-1,抑菌效果強(qiáng)于八角茴香提取物,結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果表明該物質(zhì)確實(shí)是八角茴香提取物中抑制蘋果輪紋病菌的有效成分。

真菌的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁是殺菌劑的重要靶位,植物源抑菌物質(zhì)會(huì)破壞真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁,增大細(xì)胞膜的通透性,從而導(dǎo)致細(xì)胞中的內(nèi)含物外滲,病原菌的生長受到抑制[30]。曾志紅等[31]發(fā)現(xiàn)枝孢霉菌菌絲細(xì)胞膜是丁香提取物重要的作用靶位?？扇苄缘鞍?、還原糖、丙酮酸等是反映病菌菌絲體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到外界刺激后生理變化的重要指標(biāo)。可溶性蛋白是菌體細(xì)胞的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),是細(xì)胞生物膜的保護(hù)物質(zhì),可以提高細(xì)胞的保水能力。還原糖是菌體細(xì)胞內(nèi)的主要能量物質(zhì),是構(gòu)筑菌體結(jié)構(gòu)的物質(zhì)前體。丙酮酸是糖代謝途徑的中間產(chǎn)物之一,在糖、脂肪、蛋白質(zhì)這3大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程中起著中心作用。

本研究通過分光光度法研究反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的病菌菌體內(nèi)可溶性蛋白、丙酮酸、還原糖的含量的影響,結(jié)果表明病原菌菌體內(nèi)可溶性蛋白、丙酮酸、還原糖的含量隨著反式茴香腦濃度的增大而有不同程度的降低。菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量減少表現(xiàn)在兩方面,其一可能是是反式茴香腦抑制供試菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,其二可能是反式茴香腦作用于菌體細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體內(nèi)可溶性蛋白外滲。還原糖含量減少,可能是反式茴香腦影響菌體的糖代謝途徑使得還原糖合成受阻,同時(shí)導(dǎo)致丙酮酸合成受阻,丙酮酸含量減少；或是膜結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致還原糖外滲,導(dǎo)致最終菌體應(yīng)能量供應(yīng)不足而死亡。這些均表明反式茴香腦能通過干擾菌絲體的物質(zhì)代謝從而阻止其正常的發(fā)育。

綜上所述,反式茴香腦增大蘋果輪紋病菌菌體細(xì)胞膜的滲透性,導(dǎo)致菌體內(nèi)可溶性蛋白及還原糖外滲,或是抑制其菌體內(nèi)物質(zhì)的合成代謝,關(guān)于反式茴香腦對蘋果輪紋病菌的具體作用靶點(diǎn)、代謝途徑及信號通路等可采用轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步研究。