楊政，聶建華，劉振宇，王陣賀，路志明

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 工學院，山西 太谷 030801；2.呂梁市興縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 興縣 033600；3.山西農(nóng)業(yè)大學 信息科學與工程學院，山西 太谷 030801)

在奶牛養(yǎng)殖過程中，高效準確的預測及診斷奶牛是否處于妊娠或發(fā)情狀態(tài)，對奶牛的健康養(yǎng)殖具有重大意義[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，奶牛在繁殖過程的不同階段，體內(nèi)分泌的孕酮含量會發(fā)生改變，進而會對生理活動造成影響[3]。因此，有效檢測孕酮含量可以準確的判斷出奶牛的生理健康狀況。

孕酮是由卵巢中的黃體細胞所分泌的一種激素，是一種小分子的環(huán)狀碳水化合物[4]。在奶牛體內(nèi)，孕酮的含量極少且分泌時間不確定，這對孕酮濃度的檢測造成了不便。目前，孕酮濃度的檢測方法主要有膠體金技術[5]、酶聯(lián)免疫法[6]和放射免疫法等[7]。但是，這些方法存在靈敏度低、操作復雜和應用推廣受限等缺點。因此，本文采用一種操作簡單，靈敏度高的電化學檢測方法對孕酮濃度進行了檢測[8]。該方法主要是通過制備電化學免疫傳感器，將抗原或抗體固定在電極表面，使其發(fā)生化學反應，并建立一種濃度信號與電信號之間的轉(zhuǎn)換關系，實現(xiàn)對物質(zhì)濃度的檢測[9]。

近年來，國內(nèi)外對孕酮濃度的檢測技術及方法進行了研究與優(yōu)化分析，U. Eletxigerra等[10]研究了一種檢測孕酮受體的電化學磁免疫傳感器，并對絲網(wǎng)印刷碳電極進行了安培檢測；Gevaerd A等[11]利用氧化石墨烯作為人工酶活性位點，對黃體酮進行了伏安測定，并用電子掃描顯微鏡觀察了氧化石墨烯修飾后的電極表面形態(tài)，采用循環(huán)伏安法對其進行了電化學分析；D Samsonova J V等[12]研究了一種快速測定全乳孕酮含量的側(cè)流酶免疫分析方法；張俊等[13]研究了一種高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的孕酮檢測方法，并對其進行了優(yōu)化分析；吳凌等[14]研究了一種新的奶牛乳汁孕酮ELISA試劑盒，并對其靈敏性和穩(wěn)定性等性能進行了優(yōu)化分析；錢偉東等[15]對檢測奶牛乳汁的孕酮免疫生物傳感器進行了優(yōu)化分析，進一步提高了孕酮檢測的精確度和靈敏度。由于上述檢測方法操作復雜，會導致檢測結果出現(xiàn)較大誤差。因此，建立一種靈敏度高、誤差小和操作簡單的奶牛孕酮濃度檢測方法成為了研究關鍵。

本文在上述研究的基礎上，以電化學分析方法為基礎，首先對裸絲網(wǎng)印刷金電極進行活化預處理和修飾，然后用蛋白A將孕酮單克隆抗體固定在電極表面，并用交流阻抗法進行表征，最后通過分析不同濃度孕酮抗體與抗原反應得到的數(shù)據(jù)，建立孕酮抗原濃度與電學阻抗之間的關系模型，實現(xiàn)孕酮濃度的檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

主要儀器設備：BS224S電子分析天平(德國Sartorius公司)；Interface1000電化學工作站(美國Gamry公司)；MilliQ超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；220 AT絲網(wǎng)印刷金電極(西班牙Dropsens公司)；SUPRA 55電鏡掃描儀(德國Zeiss公司)；PHS-3C PH酸度計(上海雷磁儀器廠)；20 μL、100 μL移液槍各一支(芬蘭Dragon公司)。

主要藥品：0.5 mol·L-1濃硫酸，鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀(上海紫一試劑廠)；金黃色葡萄球菌A蛋白(美國Sigma-Aldrich公司)；超純水(18.2 MΩ·cm)；孕酮單克隆抗體(美國Sigma公司)。

1.2 試驗方法

循環(huán)伏安法[16,17]是通過控制電極電勢以不同速率的三角波形進行一次或多次反復掃描，該掃描過程會得到電活性物質(zhì)氧化和還原反應的電流-電壓曲線。根據(jù)曲線的形狀變化，可對氧化還原反應的可逆程度進行分析，判斷反應物的化學活性。該方法適用于金、鉑、玻璃碳電極以及化學修飾電極等，是一種研究電化學體系的重要方法。

交流阻抗法[18,19]主要是將電化學系統(tǒng)控制在小幅度的工作條件下，使電極的電流或電勢按正弦波規(guī)律變化，同時對系統(tǒng)的交流阻抗(或?qū)Ъ{)進行檢測和計算，得到相對應的交流阻抗譜，實現(xiàn)對電化學系統(tǒng)中的參數(shù)計算，并對反應機理進行系統(tǒng)分析。此方法可對電極工作過程進行準確的計算分析，廣泛應用于電化學的研究領域中。

1.3 絲網(wǎng)印刷金電極預處理

本試驗所用絲網(wǎng)印刷金電極如圖1所示，主要由對電極、工作電極和參比電極組成，工作電極與其它2個電極所形成的回路，可以準確的反映出化學反應與電信號之間的轉(zhuǎn)換關系[20]。電極預處理需要確保電極在不被損壞的情況下，將其置于0.5 mol·L-1的硫酸溶液中，采用循環(huán)伏安法進行掃描，控制掃描電壓范圍在-0.1～0.5 V之間，以10 mV·s-1的掃描速率掃描10次[21]。

圖1 絲網(wǎng)印刷金電極結構示意圖Fig.1 Structural sketch of screen-printed gold electrode

1.4 電極制備

將30 μL的0.1 g·mL-1蛋白A溶液均勻涂抹于工作電極表面，在密閉潮濕的室溫條件下靜置1 h后用去離子水清洗干凈。然后將30 μL的8 mg·L-1孕酮單克隆抗體滴加于蛋白A吸附的絲網(wǎng)印刷金電極表面，在密閉潮濕的室溫條件下靜置45 min后清洗干凈。

1.5 奶牛孕酮濃度測定

首先將20 μL孕酮單克隆抗體均勻涂抹于工作電極表面，在密閉潮濕的室溫條件下靜置1 h后用去離子水和PBS清洗干凈，并將其工作電極置于電鏡掃描儀中，設置電鏡掃描儀的加速電壓為20 kV，放大1 000倍后，對工作電極表面的結合物進行觀察分析；然后將20 μL的2 mg·L-1孕酮酶標抗原均勻滴加于工作電極表面，在密閉潮濕的室溫條件下靜置45 min后清洗干凈；最后在電解液溶液中測量阻抗。

2 結果與分析

2.1 電極活化前后對比

電極預處理后，其電化學活性會發(fā)生改變，對其進行循環(huán)伏安法掃描得到的曲線和數(shù)據(jù)分別如圖2和表1所示。

由圖2與表1可知，預處理后的電極，法拉第電流增大，充電電流減少。其氧化峰Ipa增大，還原峰Ipc減小，電位差ΔEp減小，氧化峰與還原峰電流比值的絕對值|Ipa/Ipc|更接近于1。說明預處理會使電子轉(zhuǎn)移能力增強，導電性增加，提高了反應的可逆性。

圖2 電極活化前后的電極循環(huán)伏安曲線Fig.2 The electrode cyclic voltammetry curve before and after electrode activation

表1 電極表征參數(shù)對比

2.2 蛋白A固定孕酮單克隆抗體

為了保證試驗的準確和穩(wěn)定，需要對抗體固定條件進行探討。本試驗采用葡萄球菌A蛋白對預處理后的電極進行修飾，得到的電鏡掃描結果(圖3)。

由圖3可知，經(jīng)蛋白A修飾后的工作電極，表面間隙明顯減少，顆粒面積增大且數(shù)量增多，說明蛋白A在電極表面的附著效果良好。用蛋白A修飾后，將電極置于電解液中，并用交流阻抗法進行表征，得到蛋白A固定前后的電極阻抗譜圖(圖4)。蛋白A修飾前后的曲線在初始階段基本處于重合狀態(tài)，說明兩者使用的電解液溶液相同，反應較穩(wěn)定；而曲線的后面部分則發(fā)生了顯著變化，蛋白A修飾后的曲線半徑明顯增大，說明其電極阻抗值增加，進而表明了蛋白A與電極表面的結合會降低電子轉(zhuǎn)移速率。將試驗得到的阻抗數(shù)據(jù)用Zsimpwin軟件擬合出相應的阻抗Nyquist曲線，如圖5所示，具體參數(shù)如表2和表3所示。圖(a)為用Zsimpwin擬合的阻抗曲線，圖(b)為采用電路形式為R(C(RW))時的等效電路圖。根據(jù)擬合結果可知，卡方值Chisq為0.001 284，表明實測值和擬合值之間偏差程度小，擬合效果好；迭代次數(shù)Iter為2，表明等效電路在較少的迭代次數(shù)下就能實現(xiàn)等效，符合實際要求，有較高的可靠性。由表2和表3可知，電解液阻抗值R1由13.71 ohm·cm2變?yōu)?4.2 ohm·cm2，變化范圍較小，表明電極表面發(fā)生的化學反應沒有引起電解液電阻的改變；電極極化阻抗R2由1.835 ohm·cm2變?yōu)?1.53 ohm·cm2，該數(shù)值增加幅度大，進一步表明蛋白A修飾過的電極表面會結合形成一層膜性物質(zhì)，增大阻抗，減小電子的轉(zhuǎn)移速度。因此，選用蛋白A修飾的絲網(wǎng)印刷金電極，符合試驗設計要求，對固定孕酮單克隆抗體發(fā)揮了巨大作用，提高了試驗穩(wěn)定性。

圖3 工作電極的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope working electrode

2.3 蛋白A固定孕酮單克隆抗體與孕酮抗原反應試驗

將孕酮單克隆抗體固定在蛋白A修飾的絲網(wǎng)印刷金電極上，然后用電鏡掃描儀進行掃描(圖6)。當電極表面固定孕酮單克隆抗體后，其表面的顆粒狀物質(zhì)比蛋白A修飾后的多且間隙較少，符合試驗要求。由于蛋白A與孕酮單克隆抗體反應得到的主要物質(zhì)成分為蛋白質(zhì)，這將增加電極表面的阻抗值，因此在實際檢測中，可以根據(jù)阻抗值的變化來確定抗體的濃度。

圖4 蛋白A修飾前后阻抗譜Fig.4 Impedance spectra before and after protein A modification

圖5 擬合阻抗Nyquist曲線和等效電路Fig.5 Fitting impedance Nyquist curve and equivalent circuit

表2 蛋白A固定前的各元件參數(shù)

將0、1、2、4、8 mg·L-1的孕酮單克隆抗體，分別固定于蛋白A修飾后的絲網(wǎng)印刷金電極上，將電極放入電解液溶液中，選擇頻率為0.1～100 000 Hz之間，進行交流阻抗法測試，得到的阻抗譜(圖7)。圖7中的反應過程分為反應動力學和擴散2個過程，高頻區(qū)是由電化學動力學控制引起的，檢測到的阻抗值主要為雙電層的容抗弧[22]。通過分析高頻區(qū)曲線的變化規(guī)律可以得出：阻抗值隨著孕酮單克隆抗體濃度的增大而增大，當濃度為0 mg·L-1時，得到的阻抗值最?。划敐舛葹?、2、4 mg·L-1時，圖中的曲線半徑相差不大，說明這些濃度的阻抗值比較接近；當濃度為8 ng·mL-1時，此時得到的阻抗值最大。由于阻抗值越大，整體反應也越充分，可以促進蛋白質(zhì)與電極表面的有效結合。而在低頻區(qū)檢測到的值主要為Warburg阻抗，該值的出現(xiàn)主要是由擴散現(xiàn)象引起的，因此可以利用擴散阻抗求出擴散系數(shù)。

表3 蛋白A固定后的各元件參數(shù)

圖6 蛋白A修飾后和固定孕酮單克隆抗體后的工作電極電鏡掃描圖Fig.6 Scanning electrode electron microscopy of protein a modified and immobilized progesterone monoclonal antibody

圖7 不同濃度的單克隆抗體固定于蛋白A修飾電極后得到的阻抗譜Fig.7 Impedance spectra of monoclonal antibodies immobilized on protein a modified electrodes at different concentrations

通過以上分析可知，電極表面發(fā)生的化學反應主要集中在高頻區(qū)，采用Zsimpwin軟件對高頻區(qū)中所得到的阻抗數(shù)據(jù)進行擬合分析。由擬合結果可知，當抗體濃度為0 mg·L-1時，阻抗值為16.31 ohm·cm2，誤差為0.798%；抗體濃度為1 mg·L-1時，阻抗值為31.21 ohm·cm2，誤差為2.371%；抗體濃度為2 mg·L-1時，阻抗值為35.21 ohm·cm2，誤差為1.057%；抗體濃度為4 mg·L-1時，阻抗值為43.59 ohm·cm2，誤差為3.224%；抗體濃度為8 mg·L-1時，阻抗值為74.72 ohm·cm2，誤差為1.923%。利用SAS軟件擬合阻抗值和固定孕酮抗體的濃度，得到的回歸曲線(圖8)。由圖8可以得出，回歸曲線為y=6.765 8x+19.911 ，R2=0.974 2，顯著性檢驗概率P值為0.0018，表明孕酮單克隆抗體濃度范圍在0～8 mg·L-1時，阻抗值與抗體濃度呈線性關系，具有較好相關性。該曲線可以較好的區(qū)分0、1、2、4、8 mg·L-15個濃度的單克隆抗體溶液，但是當抗體濃度大于8 mg·L-1時，其線性擬合曲線不是很理想，且基本與8 mg·L-1時的阻抗值相同，因此本試驗選取抗體濃度為8 mg·L-1時來制作孕酮阻抗傳感器。為了提高試驗反應速率，需要確定孕酮單克隆抗體和孕酮之間的最優(yōu)濃度比。因此，用濃度為2 mg·L-1孕酮抗原分別與濃度為0、1、2、4、8 mg·L-1的孕酮單克隆抗體進行反應，反應過程采用交流阻抗法進行表征分析。交流阻抗譜如圖9所示。由圖9可知，當抗體濃度不斷增大時，曲線半徑也在不斷變大，進而表明抗體與孕酮反應時，其結合所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)等復合物的物質(zhì)濃度會增加，使電子轉(zhuǎn)移時受到的阻礙增大，轉(zhuǎn)移速率降低。通過Zsimpwin擬合阻抗數(shù)據(jù)得到不同濃度的抗體阻抗值由高到低依次為：8 mg·L-1時為275.8 ohm·cm2、4 mg·L-1時為223.9 ohm·cm2、2 mg·L-1時為153.5 ohm·cm2、1 mg·L-1時為105.4 ohm·cm2和0 mg·L-1時為50.43 ohm·cm2，且誤差分別為2.17%、1.864%、3.818%、2.888%和1.876%。用SAS軟件將阻抗值與抗體濃度進行回歸擬合，得到回歸曲線(圖10)。由圖10可知，孕酮單克隆抗體濃度在0 ～ 8 mg·L-1范圍時，隨著抗體濃度的逐漸增大，其對應的阻抗值也在逐漸增大。得到的線性回歸方程為y=27.183x+80.258,決定系數(shù)為R2=0.9093，顯著性檢驗概率p值為0.0119，具有較好的相關性。但是當抗體濃度大于8 mg·L-1時，其線性擬合曲線不理想，因此，采用8 mg·L-1的孕酮單克隆抗體作為最優(yōu)孕酮阻抗傳感器的固定抗體濃度。

圖8 阻抗值與單克隆抗體濃度的回歸曲線Fig.8 Regression curve between impedance value and monoclonal antibody concentration

圖9 2 mg·L-1孕酮與不同濃度的單克隆抗體反應得到的阻抗譜Fig.9 Impedance spectra of 2 mg·L-1 progesterone reaction with monoclonal antibodies of different concentrations

圖10 孕酮單克隆抗體濃度和阻抗的回歸曲線Fig.10 Regression curve of concentration and impedance of progesterone monoclonal antibody

3 討論與結論

(1)預處理后的電極，法拉第電流增大，充電電流減少。其氧化峰Ipa增大，還原峰Ipc減小，電位差ΔEp減小，氧化還原電流比|Ipa/Ipc|更接近于1。說明預處理會使電子轉(zhuǎn)移能力增強，有利于提高孕酮阻抗傳感器的靈敏度。

(2)選用蛋白A修飾的絲網(wǎng)印刷金電極固定孕酮單克隆抗體后，將測得的阻抗數(shù)據(jù)用Zsimpwin進行擬合，得到的卡方檢驗值Chisq為0.001 284，等效電路迭代次數(shù)Iter為2，表明擬合效果好，可靠性高。其極化阻抗值為31.53 ohm·cm2，遠遠大于裸電極的極化阻抗值1.835 ohm·cm2，使電化學活性顯著增強。

(3)由電鏡掃描圖分析可知，經(jīng)蛋白A修飾后的工作電極，表面間隙減少，顆粒面積增大且數(shù)量增多，說明蛋白A在電極表面的附著效果良好。當電極表面固定孕酮單克隆抗體后，其表面的顆粒狀物質(zhì)比蛋白A修飾后的多且間隙較少，符合試驗要求。

(4)孕酮單克隆抗體濃度x和阻抗y之間的回歸曲線方程為y=27.183x+80.258，R2=0.909 3，顯著性檢驗概率P值為0.011 9，呈現(xiàn)出良好的線性關系，并得出了最優(yōu)孕酮阻抗傳感器的固定單克隆抗體濃度8 mg·L-1。該檢測方法靈敏度高，符合實際檢測要求。